2017 Fiscal Year Research-status Report
疾患モデルマウスを用いた常位胎盤早期剥離に対する革新的治療法の開発
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16K11105
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| Research Institution | Kyorin University |
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Principal Investigator |
長島 隆 杏林大学, 医学部, 講師 (40338116)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 常位胎盤早期剥離 / 子宮特異的 / ノックアウトマウス / BMPR2 / BMP4 / BMP7 / 脱落膜化 / 妊孕性低下 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者は、自身で作成したBMPR2を子宮特異的に欠損するマウス（Bmpr2 cKO）が常位胎盤早期剥離を来すこと、さらに、BMP蛋白に分類されるBMP4とBMP7が、妊娠子宮内におけるBMPR2のリガンド候補蛋白であることを明らかにしている。そこで本研究は、全組織でBMP4またはBMP7を欠損するマウス（Bmp4 KOとBmp7 KO）が胎生致死であることから、子宮特異的にBMP4とBMP7を欠損するマウス（Bmp4 cKOとBmp7 cKO）を作成し、その表現形を解析することで、BMP4とBMP7がどの様に常位胎盤早期剥離の発症メカニズムに関与するのかを検討する。さらに、得られた知見を基に治療標的因子を同定することで、同疾患の革新的な新規治療法を開発することを最終目標としている。
これまでの研究成果により、Bmp4 cKOは、着床から妊娠６日目までの妊娠子宮において、その妊娠子宮の重量や着床関連遺伝子（Ptgs3、Areg、Wnt4、Wnt6）の発現で、コントロールマウス（Bmp4 Ctrl）との間に差を認めなかった。しかし妊娠7日目以降で、Bmp4 cKOの妊娠子宮が経時的な重量減少を示し、Bmp4 Ctrlと比較してBmp4 cKOの妊孕性が極度に低下すること、要因として妊娠の維持に必要な子宮内膜の脱落膜化が機能不全に陥ることを明らかにした。また、脱落膜化不全の原因として脱落膜化細胞の分化と増殖が減弱していること、脱落膜化組織内の血管新生が障害され血管径が細くなっていること、さらにその原因として、血管新生を制御する遺伝子の発現が低下していることを明らかにした。Bmpr2 cKOの妊娠子宮でも同様に、脱落膜化細胞の分化と増殖の減弱による機能不全と、子宮ラセン動脈の血管新生に異常を認めることから、BMP4が胎盤形成期における、BMPR2のリガンドであると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は、妊娠したBmp4 cKOで脱落膜化不全が生じるメカニズムの解明と、その介在因子の同定を試みた。胎児の絨毛膜細胞を標的とした免疫組織科学染色（IHC）で、Bmp4 cKOでは特に異常を認めなかったこと、Real-time PCRを用いた遺伝子発現解析で、絨毛膜細胞に特異的な遺伝子（Prl3d1）の発現は両マウス間で同等であったことから、Bmp4 cKOで認めた妊娠子宮の重量減少は、脱落膜化組織の異常によるものと考えられた。Bmp4 cKOの脱落膜化組織に対するアルカリフォスファターゼ染色を行い、その染色強度が著明に減少していたため、Bmp4 cKOの妊娠子宮において、脱落膜化細胞の分化に機能不全が生じていると考えられた。また、細胞増殖の指標であるKI67蛋白を標的としたIHCと、その陽性細胞数の比較検討を行ったところ、脱落膜化細胞の陽性細胞数が著明に減少していた。さらに、セルソーターによる細胞周期解析を行い、S期とG2期にある脱落膜化細胞の細胞数が著明に減少していたことから、脱落膜化細胞の増殖にも異常が生じていると考えられた。一方、血管内皮細胞で分泌されるPECAM1蛋白を標的としたIHCを行い、血管径の評価を行ったところ、脱落膜化組織内の血管径が狭窄していた。また、Real-time PCRを用いて血管新生を制御する遺伝子（Vegfa、Angpt2、Angpt4）の発現解析を行ったところ、その発現が著明に低下していたため、子宮ラセン動脈の血管内皮細胞と胎児の絨毛膜化細胞の間で行われる、子宮ラセン動脈のリモデリングにも異常が生じていると考えられた。しかし、当初予定していた介在因子の同定を、本年度までに終えることはできなかった。よって、常位胎盤早期剥離の発生機序、ならびに同疾患とBMPR2やBMP4との関連を明らかにする実験を、まだ開始するまでには至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
Bmp4 cKOの妊娠子宮または人為的脱落膜化子宮を用いて、マイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現解析を行う。その上で、既に得ているBmpr2 cKOマウスのマイクロアレイによる解析結果と比較検討することで、BMP4-BMPR2に関与するシグナル伝達経路を解明する。さらに、Real-Time PCR、Western Blotting、免疫組織染色など複数の実験手法を用いて、解析結果の確認を行う。その後は、同解析により得た知見をもとに、常位胎盤早期剥離の治療標的因子となり得るシグナル伝達物質の候補因子をピックアップする。
ピックアップした候補因子の絞り込みは、BMPR2に識別蛋白質であるTagを結合させた複合蛋白質を作成し、妊娠子宮から抽出した蛋白分画と混合し免疫沈降を行うことで、BMPR2と直接的または間接的に結合した未知のシグナル伝達物質を精製することから開始する。最終的には、精製後のシグナル伝達物質を、2次元電気泳動、核磁気共鳴法、質量分析法、Two-Hybrid法などで同定し、前述のピックアップされた候補因子のリストと照合することで、どのシグナル伝達物質が常位胎盤早期剥離の標的因子となり得るか検討する。
一方、本年度は、Bmp4ウイルスベクターを作成したのち、マウスに投与することで、Bmp4 cKOで認めた妊娠子宮内での異常が改善されるのかを同時に確認する。さらに、同定した治療標的因子に対する誘導的な遺伝子制御ベクターも作成し、常位胎盤早期剥離に対するベクターの有効性と安全性を確認することで、最終目標である革新的治療の創造に結びつける。
なお、Bmp7 cKOは、他のグループからBmp4 cKOと同様の妊孕性低下と妊娠子宮内での異常が確認され、BMP4と同じく胎盤形成期においてBMPR2のリガンドとして働いている可能性が論文で示されたため、一連の実験を中止とする。
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| Causes of Carryover |
Bmp4 cKOの脱落膜化不全が同定された当初は、まずBmp4 cKOの妊娠子宮に対して、マイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現変化の解析を計画していた。しかし、無計画にマイクロアレイを行えば、結果として得られる無数の遺伝子発現変化の中から、どの遺伝子の発現変化が脱落膜化不全に関与するのか、同定が困難になると考えられた。そこで、マイクロアレイによる解析を行う前に、免疫組織科学染色、Real-time PCR、Western blottingなど複数の手法を用いて、脱落膜化不全のメカニズムをある程度解明しようと試みた。その結果、脱落膜化細胞の分化と増殖に異常が生じ、細胞周期のS期とG2期に関与する遺伝子の発現変化が、その原因である可能性が示唆された。さらに、子宮ラセン動脈のリモデリングに異常が生じ、VEGFsやANGPTsなど血管新生に関与する遺伝子の発現変化が、その原因である可能性も示唆された。次年度は、これらの知見をもとにマイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現解析を行い、常位胎盤早期剥離の発生機序、ならびに同疾患とBMPR2やBMP4との関連を明らかにする予定である。従って、マイクロアレイのために予定していた本年度分を、次年度に持ち越すこととなった。また、Bmp4ウイルスベクターや、同定した治療標的因子に対する誘導的な遺伝子制御ベクターの作成にも、本年度分を使用予定である。
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