2016 Fiscal Year Research-status Report
妊娠時インフルエンザウイルス感染重症化に関与する自然免疫リンパ球(ILC)の解析
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16K11115
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
山崎 元美 日本大学, 医学部, 研究員 (40376794)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 樹生 日本大学, 医学部, 客員教授 (40167721)
東 裕福 日本大学, 医学部, 助教 (60772936)
村瀬 隆之 日本大学, 医学部, 助教 (70276723)
千島 史尚 日本大学, 医学部, 准教授 (50277414)
市川 剛 日本大学, 医学部, 助教 (80599994)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | インフルエンザ重症化 / 妊娠 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2009年にパンデミックを引き起こしたインフルエンザウイルスは基礎疾患のある人、乳幼児、妊婦などで重症化が報告されている。幸い本邦では、妊婦の死亡は報告されていないが、海外では死亡や入院率の増加が報告されている。しかし、なぜ重症化を引き起こしたのか、そのメカニズムは未だ解明されていない。高齢出産、少子化傾向にある本邦において、インフルエンザウイルス感染による妊娠時の重症化メカニズムの解明は急務である。
本研究では、2009年にパンデミックを引き起こしたH1N1株であるA/Kyoto/KU4/2011を用いて妊娠感染動物モデル作製し、自然免疫系の一つである自然免疫リンパ球(ILC)に着目し、妊娠中のインフルエンザウイルス感染が母児に及ぼす影響と重症化するメカニズムの解明を目的とする。
本年度は、非妊娠マウスと妊娠マウスの各組織における自然免疫リンパ球(ILC)のNCRs発現検討と各組織から分離した細胞のサイトカイン産生能を検討を行うために肺、脾臓、胎盤(妊娠マウス)からの自然免疫リンパ球(ILC)を含む細胞の分離方法を検討した。分離には、コラゲナーゼを用い、パーコールでの比重遠心の濃度を検討した。フローサイトメーターを用いて、脾臓、胎盤から分離した細胞の表面マーカーの検討を行った。次に、サイトカイン産生細胞の同定をするために、サイトカイン産生細胞を同定するために、各組織から分離した細胞をPMA、Ionomycin、Brefeldin Aを添加し、試薬濃度や培養時間等の条件検討を行い、フローサイトメーターを用いて、サイトカイン産生細胞を検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
非妊娠マウスと妊娠マウスの脾臓から細胞を分離し、フローサイトメーターでT細胞、B細胞、NK細胞、NCR(natural cytoxicity receptor)の発現検討を行なった。妊娠マウスの胎盤組織からコラゲナーゼと比重遠心法を用いた細胞分離方法を確立した。胎盤から分離した細胞ではT細胞やB細胞よりもNK1.1陽性のNK細胞が多く存在していた。
肺組織からの細胞分離方法を検討する予定であったが、胎盤と同様の方法で行ったところ、予想以上に分離できた細胞数が少なく、今後、さらなる分離方法の検討が必要となる。この点がやや遅れている原因である。
脾臓細胞を用いて、サイトカイン産生の培養条件の検討を行い、至適濃度、至適培養時間を確立したが、胎盤および肺組織から分離した細胞ではまだ検討を行っておらず、この点がやや遅れている原因である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、肺組織からの細胞分離条件を検討を行う。すでに脾臓細胞を用いたフローサイトメーターの設定は済んでいるので、同様に表面マーカーの検討を行う。サイトカイン産生の培養条件も確立されているので、同様の条件で検討を行う。非感染マウスでの検討が終わり次第、同様の条件で、パンデミック株であるH1N1を感染させ、検討を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
非妊娠マウスを用いて肺組織からの細胞分離方法の検討を行ったが、予想以上に細胞数が取れず、妊娠マウスでの検討が行えなかったため、妊娠マウスの購入代、飼育代、分離試薬、染色抗体の購入を控えたため、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
肺組織からの細胞分離条件をさらに検討するために、コラゲナーゼやディスパーゼなどの酵素、比重遠心のためのパーコール、PBS等と、非妊娠マウスおよび妊娠マウスの購入、飼育代として使用する予定である。
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