子宮体癌の微小環境を増悪させるマイクロRNA-EZH2フィードバックループの解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K11123
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 金野 陽輔 北海道大学, 医学研究科, 助教 (10572703)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 董 培新 北海道大学, 医学研究科, 特任助教 (50602504) ; 櫻木 範明 北海道大学, 医学研究科, 特任教授 (70153963)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 癌 / 遺伝子 / microRNA / EMT

Outline of Annual Research Achievements

当研究では、負のmiRNA-EZH2 feedback制御loopによるEZH2発現の制御機構を明らかにすることを目的とした。平成28年度までの研究成果として、EZH2を標的とする癌抑制miRNAを同定した。具体的には、マイクロアレイを用いて、我々の研究室で体癌細胞HEC-50 から樹立された高浸潤性亜細胞株と親株のmiRNA発現を比較することで、高浸潤性亜細胞株で発現量が低値を示すmiR-124とlet-7bなどを、浸潤抑制に関わるmiRNA候補として同定した。そして、同意の得られた体癌患者の手術組織検体から、採取した癌と周辺正常組織からtotal RNAを抽出し、Realtime PCRによりmiR-124とlet-7bなどの発現低下を確認した。TargetScanとmiRDBなどのデータベースを用いて、EZH2を標的とするmiRNA群をin silicoで予測し、更にEZH2を制御する癌抑制miRNAを同定した。miR-124とlet-7bを強制過剰発現またノックダウンし、癌細胞の浸潤能をinvasion assayで、増殖能をclone formation assayで、スフェア形成能をsphere formation assayで、抗癌剤に対する耐性をMTT assayで、EMT、増殖関連遺伝子及び癌幹細胞マーカー遺伝子発現の変化をRealtime PCRとWestern blot法により検討することで、体癌細胞の悪性形質を抑制するmiRNAの同定を行った。その結果、miR-124とlet-7bはEZH2遺伝子の3′-非翻訳領域と直接に結合し、EZH2遺伝子のmRNAとタンパク発現の発現を負に調節し、癌細胞の浸潤能、増殖能、スフェア形成能、抗癌剤に対する耐性またEMT形質を抑制することを明らかにした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究計画に基づき、体癌細胞HEC-50から癌抑制miRNA候補群の抽出を行い、これらの機能を細胞実験より解析した。その結果、miR-124とlet-7bを、EZH2を標的とする癌抑制miRNAとして同定した。これは研究計画通りの成果であり、順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

研究計画に基づき、EZH2によるmiRNA発現の制御を解明する。ゲノム編集技術であるCRISPR/Cas9法を用いて、EZH2遺伝子をノックアウトし、miRNAマイクロアレイによりEZH2によって負に調節される miRNAを抽出し、その機能解析を行う。また、miRNAのプロモーター配列を含むルシフェラーゼベクターを作製して、EZH2発現ベクターと同時に体癌細胞に導入して、ルシフェラーゼアッセイによってEZH2により直接的に発現抑制されるmiRNAを同定し、miRNA-EZH2フィードバックループによるEZH2高発現の調節機構を明らかにする。

Causes of Carryover

研究は計画通り進展しており、論文としてまとめる見通しが立ってきており、EZH2によって負に調節される miRNAを抽出し、その機能解析に必要な試薬を購入する必要があったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

研究成果を報告するための学会参加を予定している。論文掲載料に充てる予定もある。また、クロマチン免疫沈降キット、PCRアレイキット、miRNA解析用試薬、ルシフェラーゼベクターを作製と癌細胞株の維持に必要な物品の購入に使用する予定である。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Tennessee(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: University of Tennessee
• [Int'l Joint Research] Sun Yat-sen University Cancer Center(中国)
  • Country Name: CHINA
  • Counterpart Institution: Sun Yat-sen University Cancer Center
• [Journal Article] KLF4 expression enhances the efficacy of chemotherapy drugs in ovarian cancer cells (2017)
  • Author(s): Wang B, Shen A, Ouyang X, Zhao G, Du Z, Huo W, Zhang T, Wang Y, Yang C, Dong P, Watari H, Pfeffer LM, Yue J
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 484 Pages: 486-492
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2017.01.062
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Lentiviral CRISPR/Cas9 vector mediated miR-21 gene editing inhibits the epithelial to mesenchymal transition in ovarian cancer cells (2017)
  • Author(s): Huo W, Zhao G, Yin J, Ouyang X, Wang Y, Yang C, Wang B, Dong P, Wang Z, Watari H, Chaum E, Pfeffer LM, Yue J
  • Journal Title: J Cancer Volume: 8 Pages: 57-64
  • DOI: 10.7150/jca.16723
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] MiR-137 and miR-34a directly target Snail and inhibit EMT, invasion and sphere-forming ability of ovarian cancer cells (2016)
  • Author(s): Dong P, Xiong Y, Watari H, Hanley SJ, Konno Y, Ihira K, Yamada T, Kudo M, Yue J, Sakuragi N
  • Journal Title: J Exp Clin Cancer Res Volume: 35 Pages: 132-141
  • DOI: 10.1186/s13046-016-0415-y
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Suppression of iASPP-dependent aggressiveness in cervical cancer through reversal of methylation silencing of microRNA-124 (2016)
  • Author(s): Dong P, Xiong Y, Watari H, Hanley SJ, Konno Y, Ihira K, Suzuki F, Yamada T, Kudo M, Yue J, Sakuragi N
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 6 Pages: 35480-35491
  • DOI: 10.1038/srep35480
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Reactivating the expression of silenced miR-124 for endometrial cancer treatment (2016)
  • Author(s): Dong P, Konno Y, Sakuragi N
  • Organizer: The 7th Annual World Gene Convention
  • Place of Presentation: Shanghai(China)
  • Year and Date: 2016-11-03 – 2016-11-05
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Suppression of iASPP-dependent aggressiveness in cervical cancer through reversal of methylation silencing of microRNA-124 (2016)
  • Author(s): 董 培新, 井平 圭, 金野 陽輔, 渡利 英道, 櫻木 範明
  • Organizer: 第15回日本婦人科がん分子標的研究会
  • Place of Presentation: ホテルニューオータニイン札幌(北海道札幌市)
  • Year and Date: 2016-08-19 – 2016-08-20
• [Presentation] Targeting EZH2-miR-361-Twist axis in endometrial cancer (2016)
  • Author(s): Dong P, Ihira K, Konno Y, Sakuragi N
  • Organizer: The 6th Annual World Congress of Molecular & Cell Biology
  • Place of Presentation: Dalian(China)
  • Year and Date: 2016-04-25 – 2016-04-28
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] EZH2 stimulates Twist expression by epigenetic silencing of its suppressor miR-361 through an YY1-dependent mechanismEZH2 stimulates Twist expression by epigenetic silencing of its suppressor miR-361 through an YY1-dependent mechanism (2016)
  • Author(s): Ihira K, Dong P, Hanley SJ, Yamada T, Sakuragi N
  • Organizer: 第68回日本産科婦人科学会学術講演会
  • Place of Presentation: 東京国際フォーラム(東京都千代田区)
  • Year and Date: 2016-04-21 – 2016-04-24
• [Remarks]
  • URL: http://scholar.google.com/citations?user=Ze3zls4AAAAJ
• [Remarks]
  • URL: https://www.researchgate.net/profile/Peixin_Dong