温度応答性培養皿を利用した真珠腫上皮シートの作製と真珠腫の病態解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K11195
• Research Institution: Dokkyo Medical University
• Principal Investigator: 田中 康広 獨協医科大学, 医学部, 教授 (40266648)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 再生医学 / 細胞・組織

Outline of Annual Research Achievements

真珠腫性中耳炎の成因ならびに病態を解明するため、温度応答性培養皿を利用して真珠腫上皮細胞を三次元培養させ、真珠腫上皮シートの作製を目的に研究を行った。また同時に正常なケラチノサイトを培養し、中耳粘膜シートと重合させて人工鼓膜の作製を試みた。具体的に真珠腫性中耳炎の術中検体から真珠腫上皮ならびに正常な外耳道皮膚の一部を採取し、真珠腫上皮細胞と外耳道皮膚のケラチノサイトを分離して初代培養を行った。その後、ケラチノサイトは温度応答性培養皿上で重層化させ、鼓膜上皮層にあたる鼓膜上皮シートの作製を行っている段階である。一方、真珠腫上皮細胞に関しても同様の手法で真珠腫上皮シートの作製を試みた。これまでに鼓膜上皮シートに関してはKi-67の発現様式からは正常皮膚と同様な増殖能を有し、caspase-14の発現からは正常な分化であることを確認した。さらに、電子顕微鏡下での観察では基底板の存在や顆粒層におけるtight junctionの存在より、正常な鼓膜上皮層と類似した構造を確認した。真珠腫上皮シートに関しては細菌感染性疾患に起因する細菌や真菌によるコンタミネーションの問題により細胞シートの作製が出来ない状態が継続していたが、抗菌薬の種類を変更し、初期培養における対応を変化させることにより、真珠腫上皮シートを作製し得た。しかし、温度応答性培養皿による培養のみでは上皮細胞の重層化が困難であり、重層扁平上皮としての構造を構築するための技術を考案しているところである。
人工鼓膜の作製に使用する中耳粘膜シートに関しては前回その作製に成功し、正常中耳粘膜とほぼ同様な組織構造が観察されたことを報告した。現在は正常なケラチノサイトを培養して作製した鼓膜上皮シートと中耳粘膜シートがECMを介し、表裏一体となるように融合させ、三次元人工鼓膜の作製を試みている最中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

真珠腫上皮シートの作製過程における細菌や真菌のコンタミネーションの問題に対しては、培養の際に使用する抗菌薬や他の培養液の構成成分の調整によって解決した。しかしながら真珠腫上皮シートの作製には漕ぎ着けたものの、現在の培養方法では上皮の重層化が起こらないため、重層化させる方法に難渋しており、その結果として研究が停滞している状況にある。

Strategy for Future Research Activity

真珠腫上皮シート作製における細胞の重層化が困難である問題点に関しては、温度応答性培養皿による通常の培養方法ではなくair-liquid interface methodを採用し、上皮の重層化を促進させたいと考えている。引き続き、真珠腫上皮シートの作製を順次進め、各種タンパクの発現や産生について検討していく。また鼓膜上皮シートと中耳粘膜シートの重合に関しても技術的な問題を解決し、次年度の研究につなげるよう努力する。

Causes of Carryover

理由：実験に使用する抗体や試薬を購入するには本年度分の予算では不足するため、次年度分として購入するため、少ない残金を翌年度に繰り越した。

使用計画：次年度の研究計画に則って研究に必要な抗体や試薬、細胞培養などにかかる消耗品費として使用することを計画している。