2018 Fiscal Year Research-status Report

グルタミン酸イメージングによる加齢性難聴の病態解明

Research Project

Project/Area Number	16K11204
Research Institution	National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities
Principal Investigator	鷹合秀輝国立障害者リハビリテーションセンター(研究所), 研究所感覚機能系障害研究部, 研究室長 (70401354)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	大島知子独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), 分子細胞生物学研究部, 研究員 (50731783)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2020-03-31
Keywords	加齢性難聴 / グルタミン酸イメージング / 蝸牛 / 有毛細胞 / 蝸牛神経 / シナプス / 聴覚
Outline of Annual Research Achievements	本研究では加齢性難聴モデルとしてC57BL/6Jマウス等を用い、若齢群と加齢群に分けて内耳・内有毛細胞および外有毛細胞のシナプス伝達機能を細胞レベルで比較する。このために興奮性シナプスの神経伝達物質であるグルタミン酸に結合する蛍光プローブを活用して、内耳にある内・外有毛細胞と蝸牛神経間のシナプスを対象としてグルタミン酸の開口放出を可視化する。そして若齢群と加齢群の神経伝達物質放出様式を比較し、「加齢に伴い有毛細胞シナプスにおける神経伝達物質放出量が減少する」という仮説を検証して加齢性難聴の病態を解明する。以下に平成30年度の研究成果を記す。 1．若齢・加齢C57BL/6Jマウスの蝸牛・内有毛細胞リボンシナプスを対象としてグルタミン酸イメージング実験を継続している。内有毛細胞からのグルタミン酸放出に伴う蛍光シグナル変化は検出可能であるものの、時間解像度が秒単位と十分とは言えない。 2．蝸牛と同様のリボンシナプス構造を有する網膜双極細胞リボンシナプスを対象としてグルタミン酸イメージング実験を行い、そこから得られたノウハウを蝸牛の実験に還元する方策を取った。　シナプスリボンに特異的に結合するペプチドを用いて神経伝達物質放出部位を標識した上で、グルタミン酸蛍光プローブにより神経伝達物質放出をリアルタイムで高速記録（時間解像度：20ミリ秒）することに成功した。 3．難聴遺伝子Otoferlinが蝸牛有毛細胞リボンシナプスにおいて神経伝達物質放出のモードを制御するという新規知見を得て、原著論文として国際誌に発表した（Takago H, Oshima-Takago T, Moser T. Front Mol Neurosci. 11:492, 2019）。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 前年度に引き続き、C57BL/6Jマウスの蝸牛・内有毛細胞リボンシナプスを対象としてグルタミン酸イメージング実験を行った。内有毛細胞からのグルタミン酸放出に伴う蛍光シグナル変化は検出可能であったが、時間解像度が秒単位に留まるという問題点を解決することができなかったため、蝸牛と同様のシナプス構造を有する網膜双極細胞リボンシナプスを対象としてグルタミン酸イメージング実験を行い、そこから得られたノウハウを蝸牛の実験に還元する方策を取った。シナプスリボンに特異的に結合するペプチドを用いて神経伝達物質放出部位を標識した上で、リボンシナプス用に最適化したグルタミン酸蛍光プローブを用いて、神経伝達物質放出をリアルタイムで高速記録（時間解像度：20ミリ秒）することに成功した。また、これらの実験と並行して、難聴遺伝子Otoferlinの新規機能に関する原著論文を国際誌に発表した。
Strategy for Future Research Activity	網膜双極細胞リボンシナプスの実験で得られたノウハウを蝸牛有毛細胞リボンシナプスの実験に還元し、加齢性難聴における有毛細胞シナプス障害のメカニズムを解明することを目指す。
Causes of Carryover	理由：研究分担者の事情により、本研究課題が延期となったため。使用計画：実験動物購入費、試薬購入費、学会出張費など