2016 Fiscal Year Research-status Report
テーラーメード医療に向けた先天性視覚障害患者に対する診断プログラム開発と臨床応用
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16K11284
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
細野 克博 浜松医科大学, 医学部, 助教 (60402260)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 美保 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (50252242)
横井 匡 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 感覚器・形態外科部, 医師 (80514025)
堀田 喜裕 浜松医科大学, 医学部, 教授 (90173608)
蓑島 伸生 浜松医科大学, 光尖端医学教育研究センター, 教授 (90181966)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | レーバー先天盲 / 遺伝子診断 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
小児期に発症する眼疾患は先天異常や遺伝性疾患が多い事が特徴である。小児の失明原因の3/4は遺伝性疾患であり、眼形態形成異常(無虹彩、小眼球、コロボーマ)、前眼部疾患(Peters奇形)、水晶体疾患(先天白内障)、網膜疾患(レーバー先天黒内障(LCA)、スターガルト病、家族性滲出性硝子体網膜症、若年性網膜分離症、先天性停止性夜盲、眼振・黄斑低形成)、視神経障害(遺伝性視神経萎縮)など非常に多くの先天性の視覚障害が存在する。
我々はわが国の先天性視覚障害患者に高頻度で変異が認められる原因遺伝子と日本人固有の遺伝子変異を効率よく同定できる診断法を構築し、臨床の場で迅速に遺伝子診断を実施出来る診断プログラムを開発するため検体受取から変異抽出の行程をシステム化することを目標とする。
本年度は、日本の3施設から収集した29人のLCAに対して次世代シークエンサーを用いて遺伝子変異解析を実施した。結果、29人中11人の患者からLCAの原因遺伝子RPGRIP1、GUCY2D, NMNAT1, CRB1, CEP290、CRX, IMPDH1に原因変異の可能性の高い変異を検出した。上記解析により約4割の日本人LCAから疾患原因の可能性の高い変異を同定した。既報告の欧米のLCAの変異スペクトラムとは異なっていた。日本人RPに原因変異の寄与が極めて高いEYS遺伝子変異のような高頻度変異は検出されなかった。原因変異を同定できた症例に対しては両親の検体を収集して分離解析を行う。原因変異を同定できなかった症例は、全エキソーム解析あるいは非翻訳領域やイントロン領域中に存在する変異も検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
テーラーメード医療をわが国の先天性視覚障害患者に提供する為に、効率の良い遺伝子診断法を構築し、臨床の場において迅速に遺伝子検査ができる診断プログラムの開発を目指す。その為、本年度は以下の研究をした。
(1) 先天性視覚形成障害患児の収集と病態解析による臨床データの集積
3施設より29人のLCAを収集した。各施設の眼科外来では、倫理規定に基づき遺伝子検査について十分な説明と可能な限り家族歴を調査するために詳細な問診を行い、インフォームドコンセントを得た。眼科的検査(視力検査、眼底検査、視野検査、網膜電図)については最新の機器を用いて病変を網羅的かつ詳細に検査を行った。
(2) 先天性視覚障害疾患の原因遺伝子の変異探索 a) DNAの調製と保存: 収集した検体から血液を最大5ml採取し、DNAを抽出精製した。患者より検体を採取する際に可能な限り家族の検体を同時に収集した。(b) 次世代シークエンサーを用いたターゲットシークエンス解析: 次世代シークエンサーMiSeq (イルミナ社) を使用した。変異解析する遺伝子は、遺伝性の網膜関連疾患の原因遺伝子データベースRetNetに記載されている原因遺伝子等を対象とした。ターゲット領域のプローブはアジレント社のオンラインツールSureDesign等を用いて設計し、サンプルライブラリーの作成は、HaloPlex Target Enrichment kit(アジレント社)を使用した。MiSeq用のシークエンス試薬はMiSeq Reagent Kit v2 300 cycle (イルミナ社)を使用した。NGSより出力された大量データは専用の解析ソフトウェアGenomics Workbench(CLC bio社)を用いて変異探索を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は本年度の研究を引き続き行う。
(1) 先天性視覚形成障害患児の収集と病態解析による臨床データの集積
(2) 先天性視覚障害疾患の原因遺伝子の変異探索(a), (b)を行う。更に下記の研究を追加する。(c) 変異抽出のシステム化：NGSより出力された大量データは専用の解析ソフトウェアGenomics Workbench(CLC bio社)を用いて変異探索を行う。NGSより出力されたシークエンスデータをワークフローに入力する事で変異抽出が出来るシステムを構築する。(d) 疾患原因変異の追加実験：(c)により原因変異を同定できた検体はサンガー法による確認実験と家族の検体を利用して分離解析を行う。(e)診断プログラムの検証: 開発した診断プログラムを実施し、既に同定している変異を検出出来るか検証する。
(3) 遺伝子変異と病態の評価: 得られたデータを詳細に病態解析した臨床データと統合して変異と病態の評価を行う。変異と病態を統合したデータは、わが国の先天性視覚障害患者における遺伝子変異と病態の対応関係の基盤データとなり、臨床の場で、予後予測や遺伝相談に応用する。
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| Causes of Carryover |
本研究は、次世代シークエンサーを用いて先天性視覚障害の原因遺伝子の変異探索を行う。当施設には既に必要な設備は整っている。主な消耗品はシークエンシングに用いる試薬であるが、それら研究消耗品の調達に際し、予定額より安価で購入出来たため51386円の繰越金が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当該繰越金については次年度の研究消耗品に充てる予定である。
平成28年度の成果報告を第121回日本眼科学会（東京）等で参加発表を行う為の旅費として使用する。また、研究成果の報告をJapanese Journal of Ophthalmology誌等へ投稿を予定している。その際の論文投稿費用等として使用する。
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[Journal Article] Novel HPS6 mutations identified by whole-exome sequencing in two Japanese sisters with suspected ocular albinism2016
Author(s)
1.Miyamichi D, Asahina M, Nakajima J, Sato M, Hosono K, Nomura T, Negishi T, Miyake N, Hotta Y, Ogata T, Matsumoto N.
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Journal Title
Journal of Human Genetics
Volume: 61(9)
Pages: 839-842
DOI
Peer Reviewed
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