2017 Fiscal Year Research-status Report
視細胞保護のための光作動性ペプチド誘導ベクターの開発
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16K11314
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| Research Institution | Iwate University |
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Principal Investigator |
菅野 江里子 岩手大学, 理工学部, 准教授 (70375210)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
富田 浩史 岩手大学, 理工学部, 教授 (40302088)
田端 希多子 岩手大学, 理工学部, 特任研究員 (80714576) [Withdrawn]
坂尻 徹也 盛岡大学, 栄養学部, 助教 (40412928) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 光感受性遺伝子 / 膜タンパク質 / 構造予測 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、光作動性ペプチド誘導ベクターの開発を目指す。
光受容体SyPixDはシアノバクテリアのタンパク質であり、SyPixEと結合している。これが光により解離する性質を持つ。このシステムを利用し、光を用いてタンパク質、あるいはペプチドを誘導するシステムの構築を目指す。
前年までの検討で、SyPixEのSyPixDに対する結合ドメインの検索を行ったが、SyPixEの情報が極めて少ないため、候補の絞り込みが難しく候補が多数となることが分かった。そこで光徐放システムが機能するかを調べることを第一目的すること、と変更した。そのため、SyPixEをコードする遺伝子1143bpを全て発現させようとしたが、ペプチドを徐放するには、PiexEのタンパク質と切り離す必要が出てきた。そのため、ドメインの検討が重要であると考えられた。
そこで、まずドメインの検討手法が適切であるか、我々が開発した光感受性遺伝子である改良型ボルボックス由来チャネルロドプシン1(mVChR1)を用いた実験系で調べる事とした。まず、タンパク質としての構造は、既存の報告よりクラミドモナスチャネルロドプシン2 (ChR2)を参考に、立体構造予測を行った。その結果、チャネルロドプシンのタンパク質の発現及び機能に重要である膜貫通領域において、通常の膜タンパク質の構造である7回膜貫通型ではなく、8回膜貫通型と予測された。そこでmVChR1タンパク質を免疫沈降により得て、タンパク質の末端解析を行った。その結果は、構造予測とは違い、我々が当初想定していたシグナルペプチドの切断が確認され、N末の切断が行われた7回膜タンパク質として機能していることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
前年までの検討で、SyPixEのSyPixDに対する結合ドメインの検索を行ったが、SyPixEの情報が極めて少ないため、候補の絞り込みが難しく候補が多数となることが分かった。そこで光徐放システムが機能するかを調べることを第一目的すること、と変更した。そのため、SyPixEをコードする遺伝子1143bpを全て発現させようとしたが、ペプチドを徐放するには、PiexEのタンパク質と切り離す必要が出てきた。そのため、ドメインの検討が重要であると考えられた。
そこで、まずドメインの検討手法が適切であるか、我々が開発した光感受性遺伝子である改良型ボルボックス由来チャネルロドプシン1(mVChR1)を用いた実験系で調べる事とした。まず、タンパク質としての構造は、既存のChR2における構造解析（Hideaki E. Kato, et al., Nature. 2012）を参考に、Swiss modelingを用いて3次元構造を作製した。膜貫通領域はTMHMM法により、アミノ酸の結合・フォールディング予測はRobetta beta modelにより求めた。この結果、mVChR1は8回膜貫通タンパク質と予測された。我々は開発当初からmVChR1は7回膜タンパク質であり、N末は膜移行後に切断され、タンパク質として機能すると考えていた。通常膜タンパク質は7回膜貫通型であるため、今回の予測が正しいか、実証実験を行うこととした。
mVChR1-Venusを発現させた細胞からタンパク質を抽出し、Venusタグを指標に免疫沈降を行った。その後、電気泳動で分離し、N末アミノ酸解析を行った。その結果、今回の構造予測と反し、成熟タンパク質は7回膜貫通タンパク質として存在することが分かった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回の検討から、タンパク質の予測には実証実験が必要であると考えられた。SyPixEのSyPixDに対する結合ドメインの検索については、予測ドメイン数が多い事、そして今回の結果から予見が困難な可能性が示唆された。
そこで今後は、SyPixE- SyPixDに限定せず、オプトジェネティクス遺伝子をベースに、既報告からのデータを用いた徐放システムの検討を行う事とする。また、予測解析としては引き続き、mVChR1のモデリングに基づいた機能改善を行う。本研究においては、先にモデリングを行い、実証実験を行う。我々が開発したmVChR1は発現樹立株があること、機能解析法としてパッチックランプ法が既に確立されていることから、今後はmVChR1を用いた予測・実証研究により、機能予測手法を開発していく。これらのフィードバック検証から、構造・機能の予測可能な手法を確立したいと考えている。
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| Causes of Carryover |
タンパク質の構造・機能予測に時間がかかり、実験費用に未使用分が発生した。次年度の予測実証実験にかかる試薬購入に使用する予定である。
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