2017 Fiscal Year Research-status Report
失明疾患モデルにおけるグルタミン酸を用いた内在性幹細胞誘導による網膜再生法の確立
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16K11323
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
徳田 和央 山口大学, 医学部附属病院, 助教 (50266863)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
園田 康平 九州大学, 大学病院, 講師 (10294943)
藏滿 保宏 北海道医療大学, その他, 教授 (50281811)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 網膜幹細胞 / グルタミン酸 / ミュラー細胞 / タンパク質 / 網膜再生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
感覚網膜に内在する網膜神経幹細胞をグルタミン酸よって誘導し、網膜を再生する治療法の確立を進めている。
成体ラットから分離した感覚網膜の組織培養を行い、培養液中にグルタミン酸を添加して網膜内に神経幹細胞を誘導し、誘導時に特異的に発現が上昇するタンパク質群を報告した（Tokuda et al., 2015）。また、誘導時のエネルギー動態の変化を調べ、解糖系酵素群とピルビン酸キナーゼM2型（PKM2）の発現が上昇し、網膜内の乳酸が増加、そしてPKM2が細胞質内から核内に移行することを明らかにし報告した（Tokuda et al., 2016）。一方、誘導時の解析において炎症に関連する因子にも変化がみられたため、網膜色素上皮細胞などの培養細胞を用い、変化がみられた因子による作用を検討して学会報告を行った。
上述のように、網膜幹細胞誘導時は、代謝動態として腫瘍細胞におけるワールブルグ効果様変化を呈した。そこで、腫瘍細胞における増殖時のシグナルの変化にも注目して解析し、報告を行った（Wang, Tokuda et al., 2017; Shimada, Tokuda et al., in Press）。
また、神経幹細胞の分化・増殖に関与する不飽和脂肪酸の細胞内キャリアである脂肪酸結合タンパク質に関しても、複数の学会報告を行った。
一方、神経幹細胞誘導時の細胞評価において、既存の10％ホルマリンによる網膜固定では、核内微細構造が不明瞭で、神経細胞体や神経突起の腫脹を生じ（Chidlow et al., 2011）、正確な対象評価が困難であった。そこで、網膜の形態学的評価に適切な固定液を新規に調製し、報告を行った（Tokuda et al., in Press）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
成熟網膜において、低濃度のグルタミン酸による内在性網膜幹細胞誘導が、再現性良く行えている。誘導時に特異的に発現するタンパク質群も判明し、エネルギー動態の内、糖代謝および核酸代謝の動態変化を解明している。
また、解糖系以外でも網膜幹細胞誘導時に変動する酵素群があり、エネルギー代謝全体を制御する因子の内、制御の上流に位置する候補を見つけている。
一方、グルタミン酸によって誘導される内在性網膜幹細胞は、免疫染色によりミュラー細胞マーカーと共局在を示すことから、まず成熟ラット網膜からミュラー細胞のみを安定して単離・継代するシステムを構築した。そして、単離したミュラー細胞において、遊走性・走化性を確認し、chemoattractantの解析を行っている。
更に、誘導する内在性網膜幹細胞数の増加法の検討においては、申請者グループが保有するchemical compoundにおいて作用を有する候補があり、現在検討を進めている。
以上に加えて、最終年度で使用する加齢黄斑変性モデル動物での実験の一環として、網膜色素上皮の炎症による変化や上皮間葉移行などの検討も既に行い、一部報告している。申請時の研究計画内の年次経過項目がいずれも進行していることから、実験計画は概ね順調に進んでいると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画書に従い、内在性網膜幹細胞誘導による網膜再生法の確立を目指し、次のステップを進める。
ミュラー細胞の遊走性及び走化性因子、および誘導する内在性網膜幹細胞数の増加法の検討を継続する。また、ラットex vivo網膜でのグルタミン酸による網膜幹細胞誘導を、初代ミュラー細胞を用いてin vitroで行い、細胞の経時的な形態学的変化や細胞表現系の定量を行う。
更に、加齢黄斑モデル動物において内在性網膜幹細胞の誘導を行い、組織学的および電気生理学的評価を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
理由；当初の予定より、ルミネクスを用いた液性因子解析のための試薬購入費用を抑えることができた。また、研究内容を報告する国際学会が国内で開催されたため、旅費が低く抑えられた。そのため、次年度使用額が生じた。
使用計画；質量分析によるタンパク質解析のため、機器の使用料や、機器に対応した解析関連試薬の購入に使用する予定である。また、成果に関する学会講演が採択されており、その旅費に使用する予定である。
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