2016 Fiscal Year Research-status Report
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16K11326
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
永田 真帆 京都府立医科大学, 医学部附属病院, 研究員 (40614102)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | RSPO1 / 角膜 / タイトジャンクション / カルシウム沈着 / 炎症 / S100A8/A9 / 角膜混濁 / Wntシグナル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
WntシグナルのリガンドであるRSPO1の遺伝子異常家系では両眼性の角膜混濁と手掌足底の過角化、難聴をおこす。平成27年度までの研究で、RSPO1-KOマウスで角膜混濁、角膜炎症、角膜上皮障害が徐々に出現することを確認した。角膜混濁の原因検索のための実験では、von Kossa法、電子顕微鏡により角膜上皮下へのカルシウム沈着、免疫組織染色と電子顕微鏡によりタイトジャンクションの乱れを証明し、何らかの機序でタイトジャンクションが破綻した結果、バリア機能が低下し涙液中の物質が上皮下に浸透し蓄積しているのではないかと考えられた。またRSPO1-KOマウスでは角膜上皮創傷治癒が遅延するため、RSPO1は本来創傷治癒時に創傷治癒を助ける役目があると思われた。
平成28年度は、遺伝子異常による発現変化を調べるため、RSPO1-KOマウスより角膜上皮のみを分離し、抽出したRNAを用いて網羅的遺伝子解析を行った。その結果、カルシウムを含む沈着物や炎症を引き起こしうる物質として、S100A8,S100A9の発現上昇を発見した。このS100A8とS100A9は、炎症部位に発現するタンパクでもあり、一部の研究では、発現上昇によりタイトジャンクションを障害しうる、さらには、S100A8とS100A9がヘテロダイマーを形成してカルシウムとともにアミロイドを形成するとの結果が報告されており、RSPO1-KOマウスの角膜混濁の機序の仮説にあてはまる。創傷治癒に関しては、どのような炎症であるかを確認するため、種々の炎症細胞について免疫染色を行った。その結果、創傷1週間で明らかにマクロファージが多く浸潤していることを確認した。
RSPO1は、S100A8またはS100A9の発現制御を行い、角膜上皮タタイトジャンクション構造の恒常性を維持し、また炎症を制御することで角膜透明性を保っていることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた、RSPO1-KOマウスにおいてのin vivoにおける細胞生物学的検討が行われ、その結果タイトジャンクション破綻が示された。またさらなる検索として、電子顕微鏡によりタイトジャンクション破綻と上皮下へのカルシウム沈着が証明された。これにより、RSPO1の角膜上皮タイトジャンクションへの関連が示唆された。
さらに大きな発見として、RSPO1-KOマウスの角膜上皮の網羅的遺伝子解析の結果、S100A8とS100A9の明らかな発現上昇を認め、既報より、炎症、タイトジャンクション、カルシウム沈着にかかわる因子であることから、RSPO1がS100A8またはS100A9と関連していることが強く示唆され、これらを制御することにより角膜の透明性を維持していることが明らかとなりつつある。RSPO1の角膜透明性維持機構の解析において、この発見は非常に重要な発見であり、今後のさらなる機序解明への大きな柱となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
RSPO1-KOマウスでのS100A8、S100A9の発現上昇が確認できたいま、これらの因子についての様々な研究を行うことが望まれる。具体的には、Wild-typeマウスと比べてRSPO1-KOマウス角膜上皮においてS100A8、S100A9が上昇しているかを確認するRealtime-PCR、その局在を確認するため免疫組織染色、ex vivo組織においてS100A8やA9を添加する、またこれらのagonist/antagonistを添加することによりタイトジャンクションの変化をみる（免疫組織染色）、in vitroにおいても、マウス培養角膜上皮細胞にS100A8やA9を添加するまたこれらのagonist/antagonistを添加することによりタイトジャンクションの変化をみる（免疫組織染色、電気抵抗測定）など、様々な方法で、RSPO1とS100A8、S100A9の関係についての検索を行う予定である。
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Research Products
(3 results)
