Direct reprogrammingを用いた短腸症候群の新規治療法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K11356
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 小沼 憲祥 日本大学, 医学部, 助手 (50553103)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 古屋 武史 日本大学, 医学部, 助手 (20568539) ; 松本 太郎 日本大学, 医学部, 教授 (50366580) ; 越永 從道 日本大学, 医学部, 教授 (70205376)
• Project Period (FY): 2016-10-21 – 2019-03-31
• Keywords: DFAT / Adipoq / tdTomato / exosome

Outline of Annual Research Achievements

腸管障害時、周囲脂肪組織（腸間膜）から再生への寄与を検討するために、当科にて飼育しているAdipoq/Cre マウスとROSA26-tdTomato マウスの繁殖とともに、交配して生まれたAdipoq-Cre / tdTomatoマウスの樹立を行った。次に、4-6週齢のオスAdipoq-Cre / tdTomatoマウスに対して、既報に従い5日間 Tamoxifenの腹腔内投与を1mg/bodyで行い、Tamoxifen投与から一週間後に、皮下脂肪と内臓脂肪並びに脂肪組織が存在しない肝臓、脾臓などの実質臓器を摘出した。脂肪組織は、コラゲナーゼ処理を行い、フィルトレーション後、低速遠心にて成熟脂肪細胞を単離した。成熟脂肪細胞に対して、脂肪組織マーカーであるperilipinとHoechst33258にて核染色を行い、成熟脂肪細胞中のtdTomato陽性率（赤色）を検討したところ、97-99％が陽性であった。また、実質臓器に対しては、Frozen切片を作製し、脂肪組織のない組織では赤色に染まる細胞がないことを確認した。以上より、脂肪細胞の運命を追跡できるモデルマウスの確立とした。また、腸管組織に遺伝子をデリバリーするmaterialとして、当研究室において使用している脱分化脂肪細胞(DFAT: dedifferentiated fat cell)を用いる予定であったが、近年、細胞内に存在するexosomeが、細胞間伝達に重要な役割を果たし、かつ、腹腔内投与により、腸管組織への取り込みがみられることが報告された。そこで、本実験に用いる遺伝子デリバリーを、DFATのexosomeにて行うことを考えた。DFATからのexosomeは、電子顕微鏡にて100-200nmの小胞体として確認することができ、exosomeのマーカーである、CD69をウエスタンブロッティングにて確認した

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Adipoq/Cre マウスとROSA26-tdTomatoマウスの系統維持に時間がかかり、かつ交配の結果得られてくるAdipoq-Cre / tdTomatoマウスの中でもCre陽性マウスの数が少なく、腸管炎症時の上皮再生に脂肪組織が関与していることを証明するための検討まで行えなかった。また、遺伝子のデリバリーに細胞（DFAT）を用いる予定であったが、レンチウイルスシステムを用いても、DFATに対する遺伝子導入が困難であった。そこで、遺伝子デリバリーにDFATから分泌されるexosomeに変更したことにより、exosomeに対する検討が必要になったため。

Strategy for Future Research Activity

脂肪細胞の運命追跡が可能なadipoq-cre/tdTomatoマウスに対して、腸管炎症を誘導し、腸管上皮の再生に脂肪細胞が関与していることを証明する。腸管炎症には、TNBSやDSSによる薬剤誘導性の腸管炎症と、他系統マウスの脾臓からＴリンパ球を単離し、腹腔内にリンパ球を投与することで免疫学的に腸管炎症を起こす方法が存在するが、本実験では、腸管再生に関わる脂肪細胞の関与を検討するために、薬剤性に腸管炎症を誘導する。また、脱分化脂肪細胞から分泌されるexosomeの解析を行い腸管再生に関するmiRNAやサイトカインの発現解析をマイクロアレイやReal time PCRを用いて行う。