妊娠高血圧症候群における血管内皮細胞の形態学的変化と抗凝固薬の保護効果機序の検証

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K11427
• Research Institution: St. Marianna University School of Medicine
• Principal Investigator: 日野 博文 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 准教授 (70308500)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 妊娠高血圧症候群 / グリコカリックス / 血管透過性

Outline of Annual Research Achievements

本研究目的は妊娠高血圧症候群（PIH）における血管内皮細胞障害の機序と保護因子の解明である。第一に血管内皮細胞上で防御機構を有するglycocalyx（Gcx）層のPIHにおける脱落を部位別に形態学的に検証し、Gcxと同構造を有し、第Xa因子やトロンビンを制御する抗凝固薬であるdanaparoid（DS)とthrombomodulin(r-TM)のGcx層保護効果を検証することである。
平成28年度研究実施内容としては、1）PIHモデルの作成、2)薬剤投与量、投与方法の検討、3）電子顕微鏡試料の作成方法、4)本試験の順でパイロット試験、本試験を行っている。結果としては1)PIHモデル作成ではパイロット試験（n=18）により、LPS投与量による血圧、血小板数、尿タンパク量、血漿VEGFR-1量を測定して検討した結果、対照群と大きな差が生じた最適なLPS投与量を決定した。2)薬剤投与量、投与方法の検討（n=24)ではDS、r-TMに関してそれぞれ投与量、投与方法を変え検討したが、持続投与群での母体の死亡を含む成績が悪いため、各薬剤の最適投与量を決定し単回投与による方法で研究を行うことを決定した。3)電子顕微鏡試料は脳・腎臓の毛細血管Glycocalyx層が対象として行われたが、同一個体内での2部位を染色固定することが困難であり、時間を要したが手法を変更し、最終的に灌流固定用の独立経路を確保することにより問題を解決した。1)から3)までの決定された手法、用量を用いて、現在、本試験が進行しており、動物個体としては約50%の試料が作成された状況である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

電子顕微鏡用試料として同一生体内で脳と腎糸球体の2臓器での測定において、単一経路から全身への色素注入を試みたが、毛細血管の染色が十分ではなく、また、脱血手法に関しても脳と腎とでは差異があり、問題解決までに時間を要した。
また、施設内のELISA測定機器の不具合の問題により、予想以上に時間がかかったことも要因として挙げられる。

Strategy for Future Research Activity

現在までにモデル作成手法が確定したため、今後は本試験を推進して電子顕微鏡像の評価によるDSとr-TMの保護効果を早期に確定する。
早期に平成29年度の研究である2% Evans blue dyeによる血管透過性の検討を行う。摘出の一部は切片を作製し、顕微鏡下にて形態学的変化で群間比較し、血管透過性の変化と電顕像の変化を比較し病態への理解を深めることを予定している。

Causes of Carryover

今年度分の使用額はほぼ計画的に使用した。
しかしながら、電子顕微鏡用試料の問題解決に時間を要した事、施設内のELISA測定機器の不具合の問題解決に時間を要した事から、実験計画より現状は遅れている。
その分の使用額が次年度へと繰り越されることとなっている。

Expenditure Plan for Carryover Budget

①現在実施中のPIH動物モデルにおけるGcx層形態学的変化とDS・r-TMのGcx層保護効果の検証。PIH動物の脳および腎毛細血管のGcx層を電子顕微鏡下で計測する。
②PIH動物モデルにおけるEvans blue dye染色による血管透過性の評価。PIH動物の脳および腎毛細血管を顕微鏡下で観察。残りの一部をホモジナイズし、上清を吸光度計にて計測する。