2016 Fiscal Year Research-status Report
歯周病細菌特異的病原性LPSのO抗原鎖の組成と生合成機構の完全解明
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16K11451
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
庄子 幹郎 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (10336175)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
橋本 雅仁 鹿児島大学, 理工学域工学系, 教授 (30333537)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 歯周病細菌 / リポ多糖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯周病関連細菌Porphyromonas gingivalisは、強力なタンパク質分解酵素であるジンジパインを分泌する。ジンジパインを含めた約30個の外膜タンパク質のC末端側には共通のC-terminal domain(CTD)を有しており、それは外膜への分泌シグナルとなっている。CTD含有タンパク質はIX型分泌機構(T9SS)によって菌体表面に輸送されること、さらに菌体表面に出たこれらのタンパク質はT9SSにより分泌されるPorUプロテアーゼによりCTDが切断されるとともにA-LPS(O多糖は陰性荷電を持つ)に結合すると報告されている。しかしながら、その詳細については不明な点が多い。
これまでに、本菌には2種類の組成の異なるO多糖を持つLPSが存在すると報告されており、O-LPS、A-LPSと呼ばれている。CTD含有タンパク質は菌体表面のA-LPSに特異的に結合することから、その生合成機構の解明は重要である。これまでに、トランスポゾン変異法によりA-LPS生合成に関わる複数の遺伝子が同定されている。しかしながら、未同定の遺伝子も存在する可能性があった。そこで、本菌のゲノム情報から未だ解析をしていない14個の糖転移酵素遺伝子に着目し、変異株作製を試みた。その結果、4個の遺伝子については変異株作製ができなかった。残りの10個については変異株作製ができた。そのうち、3個がA-LPS生合成に関わる新規遺伝子であった。1個はLPSがラフ型であったことから、A-LPSおよびO-LPSの両方のO多糖生合成に関わると推測された。残り2個についてはLPSがスムース型であったことから、A-LPSのO多糖生合成に関わると推測された。これまでに得られている知見と今回の結果から、少なくともA-LPSのO多糖生合成には少なくとも6個の遺伝子の関与があると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
歯周病関連細菌Porphyromonas gingivalisは9型分泌装置を持っており、保存されたC末端ドメインを有するタンパク質(CTD含有タンパク質)を分泌する。分泌されたタンパク質は、菌体表面のPorUプロテアーゼ(これも9型分泌装置で菌体表面に分泌されている)により、CTD領域が切断されるとともにA-LPSへ結合される。A-LPSはCTD含有タンパク質を菌体表面にアンカーすることから、その生合成機構の解明は重要である。
A-LPSのO多糖の合成については、最初の糖転移酵素としてWbaP、後期の糖転移酵素としてGtfBが関わることを見出していた。しかしながら、それ以外の糖転移酵素については不明であった。そこで、本菌のゲノム情報から、未解析の14個の糖転移酵素遺伝子に着目し、変異株作製を試みた。その結果、PGN_1026、PGN_1651、 PGN_1807、 PGN_2087の変異株は作製できなかった。残りの10個は変異株が作製できた。これらのうち、PGN_0361、 PGN_1240、 PGN_1668変異株は血液寒天培地上で黒色コロニー形成が減弱していた。また、これらの変異株はA-LPSを認識する抗体に全く反応しなかった。したがって、これらはA-LPS生合成に関わることを強く示唆している。PGN_1240変異株のLPSはラフ型を示し、その分子量からGtfBの直前の糖転移酵素であることが示唆された。一方、PGN_0361およびPGN_1668変異株のLPSはスムース型を示した。PGN_0361はPGN_1239のパラログであり、両者を変異するとLPSはラフ型を示した。これらのことから、PGN_0361はWbaPの次に働く糖転移酵素であると考えている。PGN_1668については、A-LPSのO多糖のどこに作用しているかは不明である。
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| Strategy for Future Research Activity |
歯周病関連細菌Porphyromonas gingivalisの病原性に関わるA-LPSの構造の詳細を明らかにする為に、A-LPSのO多糖合成に関わる遺伝子の同定を行った。これまでの知見と今回の結果から、A-LPSのO多糖は細胞質内で、WbaP, PGN_0361, PGN_1240, GtfBにより主鎖の構造が構成され、VimFとPGN_1668により側鎖の構造が構成されるのではないかと考えている。次の目的は、A-LPSのO多糖の組成を明らかにすることである。A-LPSを抽出する為に温水フェノール法を使用するのであるが、A-LPSはCTD含有タンパク質と結合しているのでフェノール層に行く為、回収量のロスになっている可能性がある。それを回避する為に、9型分泌機構の欠損株を親株として、LPSを回収する。これまでのところ、O-LPSに特異的な遺伝子は同定されていない。したがって、porK(A-LPS+ O-LPS+), porK PGN_1239 (A-LPS+ O-LPS+), porK wbaP((A-LPS- O-LPS+), porK PGN_0361 (A-LPS- O-LPS+)株を嫌気下で大量培養して集菌しLPSを回収した後、O多糖の組成解析を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
物品費として想定していた金額の支出を抑えることができたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成29年度の物品費に未使用額を上乗せした金額で支出を予定している。
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[Journal Article] A Distinct Type of Pilus from the Human Microbiome2016
Author(s)
Xu Q, Shoji M, Shibata S, Naito M, Sato K, Elsliger MA, Grant JC, Axelrod HL, Chiu HJ, Farr CL, Jaroszewski L, Knuth MW, Deacon AM, Godzik A, Lesley SA, Curtis MA, Nakayama K, Wilson IA.
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Journal Title
Cell
Volume: 165(3)
Pages: 690-703
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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