2016 Fiscal Year Research-status Report
22q11.2欠失症候群原因遺伝子による頭蓋底軟骨結合の成長維持メカニズムの解析
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16K11460
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
梶原 景正 東海大学, 医学部, 講師 (00204397)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木村 穣 東海大学, 医学部, 教授 (10146706)
青山 謙一 東海大学, 医学部, 助教 (10647530)
内堀 雅博 東海大学, 医学部附属病院, 臨床助手 (50749273)
太田 嘉英 東海大学, 医学部, 教授 (60233152)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 22q11.2欠失症候群 / DGCR2遺伝子 / ノックアウトマウス / TBX1 / 頭蓋底軟骨結合 / 軟骨細胞 / TGF-beta / BMP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Tbx1は心血管や顔面骨格などで形態形成に役割を果たし、その欠失が22q11.2欠失症候群の病態形成に関わっていることが明らかとされている。その分子メカニズムは、Tbx1が転写因子として、または直接的に作用してTGF-β／BMPシグナルを制御するとの報告がなされている。一方、Sez12は膜タンパク質としてTGF-β受容体を制御している。以上のことからSez12とTbx1が協調的にTGF-β／BMPシグナルを制御する分子メカニズムを考え、これらをコードする遺伝子のヘテロ型欠失が軟骨細胞の成長・成熟に影響を与えている可能性を本年度に検討した。
ホモ型Sez12ノックアウトマウス（Sez12-KOマウス）は全身に軽度の骨格異常が認められるが、その原因が軟骨細胞の分化異常の可能性が考えられた。特に顔面および頭蓋領域に骨格異常では、軟骨の早期消失が原因と思われる頭蓋底の形成不全が認められた。しかしヘテロ型Sez12-KOやヘテロ型Tbx1ノックアウト（Tbx1-KO）マウスではこの骨格異常は確認できず、22q11.2欠失症候群の顔面異常の原因として単独遺伝子では十分ではなかった。一方、ヘテロ型Sez12-KO／Tbx1-KOをもつダブルヘテロ型ノックアウトマウスでは、ホモ型Sez12-KOマウスと同様な顔面骨格系の異常が認められ、その原因として頭蓋底軟骨結合の軟骨細胞の質的量的異常による頭蓋底の形態的異常が引き起こされていることがわかった。以上のことから、ヒト22q11.2欠失症候群の原因遺伝子として特に顎顔面骨格形成において、Tbx1のみならずDgcr2も必要であること、ただ単独遺伝子欠失では顎顔面骨格異常には十分ではないことが示唆された。Dgcr2遺伝子は近傍の他の遺伝子と協調して顔面領域の骨格形成に役割を果たしている可能性が考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1) 既に樹立されたSez12-KOマウスは、ホモ型Sez12-KOでのみ顎顔面骨格の異常所見が認められていた。一方、Tbx1-KOマウスはヘテロ型のみ生存し、その顎顔面形態には異常は認められなかった。本年度の研究から、ヘテロ型Sez12-KO／Tbx1-KOマウスはホモ型Sez12-KOマウスに匹敵する顎顔面骨格の異常所見が認められた。また顎顔面症状は発生段階では認められず、生後の離乳時期から発症することもわかった。以上のことから、早期に遺伝子欠失が判明すれば、生後発症前に何らかの治療処置が行えることが考えられた。従って、Sez12／Tbx1が関わる骨格制御の分子メカニズムを解明することが、22q11.2欠失症候群の改善に重要な役割を果たす可能性が見出せた。
(2) 組織学的・組織化学的解析を行ない、ヘテロ型Sez12-KO／Tbx1-KO遺伝子変異の顎顔面骨格への影響を検討した。この結果、ヘテロ型Sez12-KO／Tbx1-KOマウスでみられた顎顔面異常が頭蓋底軟骨結合の肥大軟骨細胞の量的問題に起因していること、一方で増殖軟骨には影響がなかったことが明らかとなった。これらの知見を踏まえて、細胞レベルでのSez12・Tbx1のTGF-beta／BMPシグナルへの影響について検討する方向性が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度のマウス個体を用いた顎顔面骨格の解析結果から、ヘテロ型Sez12／Tbx1ダブルノックアウト（Sez12-KO/Tbx1-KO）マウスの骨格異常が顕著であった。そこで次年度からはその分子メカニズムを解明するために、変異マウス個体より調製された初代軟骨細胞を用い、いままでに明らかとなっているSez12やTbx1が制御するシグナル伝達を指標にし、軟骨細胞の増殖分化異常に関する検討を行う（梶原・青山・内堀が解析担当、梶原・木村・太田が統括）
(1) 低血清状態でTGF-betaを投与した場合、ホモ型Sez12-KO細胞では軟骨細胞の脱分化が認められる。一方、ヘテロ型Sez12-KOやヘテロ型Tbx1-KOの初代軟骨細胞では、このような細胞変化は認められない。ところがヘテロ型Sez12-KO/Tbx1-KO初代軟骨細胞では、TGF-betaやBMPを投与後にホモ型Sez12-KO細胞と類似した増殖分化異常が認められる。この変化がTGF-betaやBMPシグナルの異常に由来するのか、BMPシグナル異常の関与により増強したものなのか、Smadリン酸化や免疫細胞染色などを駆使し、これらの点について細胞レベルで解析する
(2) Sez12が膜タンパク質をコードしていることから、予想されるBMP受容体およびTGF-beta受容体との相互作用に関して、免疫沈降反応などにより検討する。そしてSez12欠失またはTbx1欠失により、TGF-beta／BMPシグナルの構成分子（Smad1, Smad2, Smad3, Smad5）と調節性Smad分子（Smad6, Smad7, Smad4）の発現量動態やリン酸化による質的動態を検討し、ヘテロ型Sez12-KO/Tbx1-KO軟骨細胞で新たに見出されるBMP/TGF-betaシグナル制御を追求する。
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| Causes of Carryover |
マウス交配により解析に用いる子孫を獲得してきたが、予想を下回る算出数であったため、マウス飼育費用が見積り以下となった。実験を全て学内技術員などで行えたため、予想した外部委託の料金や人件費が見積りを下回った。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
学内の技術員を使用するための試薬・実験器具などを購入する。主に免疫細胞染色や免疫細胞蛍光解析に用いる抗体・蛍光プローブ・ガラス器具・プラスチック器具を購入する。
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