2016 Fiscal Year Research-status Report
口腔細菌ペプチダーゼの基質となる全身疾患関連生理活性ペプチド探索の基盤研究
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16K11481
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
根本 優子 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (10164667)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
根本 孝幸 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (90164665)
下山 佑 岩手医科大学, 歯学部, 講師 (90453331)
馬場 友巳 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (60189727)
小早川 健 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 技術職員 (10153587)
木村 重信 関西女子短期大学, 歯科衛生学科, 教授 (10177917)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 歯周病菌 / ジペプチジルペプチダーゼ / 生理活性ペプチド / DPP4 / 糖尿病 / インクレチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯周病原菌であるPorphyromonas gingivalis ジペプチジルペプチダーゼ4（DPP4）遺伝子に30%以上のアミノ酸配列相同性を示す遺伝子ホモログは723種あり，そのうちHOMD（688 taxa）には37菌種が対応することを明らかにした。内訳は嫌気性菌が21菌種で多数を占め，好気性菌が12菌種，炭酸ガス要求菌が4菌種であった。グラム陰性嫌気性菌はBacteroides, Porphyromonas, Prevotella, Tannerellaの４属で，これらの細菌は歯肉縁下プラークに生息し，歯周病の原因菌の多くがDPP4活性を有する可能性を見出した。これらのうちで主要な歯周病原菌とされるP. gingivalis, Tannerella forsythia, Prevotella intermediaについてより詳細な検討を行い，菌体結合性のDPP4活性を測定し，組換えタンパク質を発現性した。細菌DPP4はN末端からジペプチドを切断し，P1アミノ酸残基がPro特異的であり，P1 Ala残基に対しても弱いながら分解活性を示すこと，また，ヒトDPP4阻害剤（P32/98，Sitagliptin, Vildagliptin）によって阻害されることから，活性中心の3次構造がヒトDPP4に類似することを示した。標的となる生理活性ペプチド探索として，in vitroでのペプチド分解についてMALDI TOF質量分析で検討し，細菌由来DPP4がインクレチンペプチドのN末端ジペプチドを分解し不活化する結果を初めて示した。さらに，マウス動物モデルにより歯周病原性細菌DPP4の生理活性について検討し，DPP4投与によりインクレチンが分解し高血糖となる結果を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
データベース検索から歯周病原菌であるPorphyromonas gingivalis DPP4のオルソログを有する口腔細菌は主に嫌気性菌であることから，歯肉縁下プラークに生息する細菌であることを明らかにした。それらのなかで，最重要歯周病原菌であると考えられるTannerella forsythiaがDPP4活性を保有し,Prevotella属菌もDPP4活性を発現することは注目に値する。P. gingivalis, T. forsythia, P. intermedia菌体でのDPP4活性を測定し，さらに組換えタンパク質を発現精製し，それらの生化学的，酵素学的特性を明らかにした。組換えタンパク質が得られたことから，標的となる生理活性ペプチド分解についてMALDI TOF-MSでの解析を行い，細菌由来DPP4がインクレチンペプチド(glucagon-like peptide-1，glucose-dependent insulinotropic polypeptide)を分解することを初めて示した。In vivoでの活性を明らかにするために動物モデルでの解析を実施し，細菌由来DPP4がマウス血中のglucagon-like peptide-1を分解する結果を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
P. gingivalisが有するジペプチジルペプチダーゼ遺伝子について，薬剤耐性遺伝子カセットを用いたDNA断片エレクトロポレーション法により種々の遺伝子破壊株を作成する。野生株，単一ペプチダーゼ遺伝子欠損株(dpp4,dpp5,dpp7,dpp11,aop)，多重ペプチダーゼ遺伝子欠損株(前述4種のDPPのダブル，トリプル，クアトロ欠損株)，及びジンジパイン欠損株（KDP136; kgp rgpA rgpB, porT欠損株），また，それぞれの組換えタンパク質を用いて，糖非発酵性であるP. gingivalisのペプチダーゼ分解活性について基質特異性，及び各種のペプチド分解能に及ぼすDPPの寄与について検討し，対象となる生理活性ペプチドの探索を進める。
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[Journal Article] Genotyping procedure utilizing nested PCR for P. gingivalis fimA demonstrates dominant preference of fimA-type I and IV in healthy children.2017
Author(s)
Shimoyama, Y., Ohara-Nemoto, Y., Kimura, M., Kimura, S., Tanaka, M., and Nemoto, T.K.
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Journal Title
Journal of Dental Sciences
Volume: 12
Pages: 213-219
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] Degradation of incretin by the prokaryotic dipeptidyl-peptidase 4 from Porphyromonas gingivalis.2016
Author(s)
Shimoyama, Y., Ohara-Nemoto, Y., Nemoto, T.K., Nakasato, M., Yaegashi, T., Ishikawa, T., Sasaki, M., Kimura, S.
Organizer
Microbe 2016
Place of Presentation
ホ゛ストン(米国)
Year and Date
2016-06-16 – 2016-06-20
Int'l Joint Research
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[Presentation] Characterization of dipeptidyl-peptidase 4 from Tannerella forsythia.2016
Author(s)
Nakasato, M., Shimoyama, Y., Ohara-Nemoto, Y., Nemoto, T.K., Takahashi, S., Ito, S., Sasaki, D., Yaegashi, T., Kimura, S.
Organizer
Microbe 2016
Place of Presentation
ホ゛ストン(米国)
Year and Date
2016-06-16 – 2016-06-20
Int'l Joint Research
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[Presentation] Porphyromonas sp. dipeptidyl peptidases 11 distinguish substrates from end products via distinct thermodynamic signatures.2016
Author(s)
Bezerra, G. A., Ohara-Nemoto, Y., Fedosyuk, S., Cornaciu, I., Hoffmann, G., Marquez, J. A., Nemoto, T.K., Djinovic-Carugo, K.
Organizer
EMBO Conference The biochemistry and chemistry of biocatalysis: From understanding to design
Place of Presentation
オウル（フィンランド）
Year and Date
2016-06-12 – 2016-06-15
Int'l Joint Research
