2016 Fiscal Year Research-status Report
唾液腺Ca2+応答の低侵襲的長期間イメージング技術の確立と機能・再生研究
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16K11484
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| Research Institution | Health Sciences University of Hokkaido |
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Principal Investigator |
谷村 明彦 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (70217149)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石井 久淑 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (00275489)
根津 顕弘 北海道医療大学, 歯学部, 准教授 (00305913)
森田 貴雄 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (20326549)
赤松 徹也 徳島大学, 大学院生物資源産業学研究部, 准教授 (80294700)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 唾液腺 / カルシウム / ウイルスベクター / in vivoイメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
唾液腺の水・電解質分泌は細胞内Ca2+濃度の上昇によるイオンチャネルの活性化がトリガーとなることから、腺房細胞のCa2+シグナルが精力的に調べられてきた。我々はアデノウイルスベクターを使って生きたラットの顎下腺腺房細胞にCa2+センサー (YC-Nano 50) 遺伝子を発現させることによって、生きた動物において唾液腺Ca2+シグナルを解析する技術を確立した。
本研究の目的は、これらの解析法を発展させて唾液腺のCa2+応答を長期間観察できる低侵襲的なin vivo 解析法を確立することである。口腔乾燥症の進行、薬物治療による唾液腺機能の回復、代償性肥大などによる唾液腺の機能亢進など１ヶ月以上の長い時間経過で進行する病態や再生の過程の解析には、持続的な遺伝子発現が必要である。また侵襲性が低いin vivoイメージング技術によって、意識レベルが保たれた状態を必要とする味覚などの口腔感覚による生理的な唾液分泌の調節機構の解析が可能になる。
そレらを実現するためにレンチウイルスあるいはゲノム編集技術を使ってラット唾液腺にCa2+センサー遺伝子を安定的に発現させる。また低侵襲的な外科的手法や光ファイバーを使った低侵襲的解析によって、無麻酔下および長期間のin vivo Ca2+測定を可能にする。このCa2+応答の低侵襲的長期間イメージング技術と、微小圧力センサーを使ったリルタイム唾液分泌測定法や、レーザースペックル血流計を使った血流イメージング法を組み合わせる事によって、唾液分泌の制御機構を解析する。
この実験法を用いて生理的刺激や薬物などによる唾液分泌刺激によるCa2+応答、および唾液腺の片側結紮に伴う反対側の代症性肥大や再解放による再生過程のおけるCa2+応答と分泌や血流の変化を明らかにする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ウイルスベクターを使った長期イメージング法の開発：長期間イメージングを実現するために、Ca2+センサー遺伝子をアデノ随伴ウイルス・ベクター（AAV）およびレンチウイルス・ベクター（LVV）に挿入してCa2+センサー発現ウイルスを作製した。これらをHSY細胞に感染させて発現効率を比較すると、AAV5と比較してAAVDJの方が２倍から７倍の高い発現を示した。また、その発現量は3日で最大になり、５日目から減少した。AAVDJ-YCnano50をこれらの細胞に感染させ多細胞から恒常発現細胞を作製したところ、低濃度のATP刺激でカルシウム・オシレーション反応が起こることが確認された。同様にしてLVVにYC-Nano50, G-GECO, R-GECOなどのCa2+センサー遺伝子を挿入したウイルスベクターを作製した。LVVによるYC-Nano50の発現は、3日頃に最大となりそのまま高い蛍光強度が維持され、は１ヶ月以上経代しても維持された。
AAVDJ-YC-Nano50およびLVVにYC-Nano50を使ってラット顎下腺へのYC-Nano50の発現を試みた。LVVにYC-Nano50を逆行性に注入した顎下腺において蛍光タンパク質の発現が観察された。その蛍光は遺伝子導入後3ヶ月を経過したラットでも認められ、アセチルコリン刺激による蛍光比の変化も確認された。これらの事から、LVV-YC-Nano50を使ってCa2+センサー遺伝子を持続的に発現させる事ができることが明らかになった。
顎下腺の導管結紮・再解放による唾液腺の再生と反対側の代償性肥大に伴う機能変化の解析：片側の顎下腺導管を結紮し、反対側にAVVを使ってCa2+センサーを発現させ、in vivo Ca2+イメージングと唾液分泌の同時解析を行った。この実験で、導管結紮後一週間程度で反対側の機能亢進が起こることが確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
ウイルスベクターの改良と低侵襲的in vivoイメージングシステムの開発：LVVのCMVプロモーターを入れ替えることによって発現効率を高める。また cAMPイメージング用のウイルスベクターを作製する。さらに内視鏡を蛍光顕微鏡に装着したイメージングシステムを構築して低侵襲的なin vivoイメージングを行う。
低侵襲的in vivoイメージングシステムを使ったイメージング解析：ウイルスベクターを使って唾液腺にYC-Nano50あるいはFlamindo2を発現させて、味覚刺激、舌や口腔内の機械的刺激等による唾液腺のCa2+応答およびcAMP濃度の変化を低侵襲的in vivoイメージングシステムで解析する。また顎下腺導管にシリコンチューブを挿入し、皮膚に固定したチューブから微小圧力センサーに接続して唾液分泌を解析する。この実験では、神経遮断性鎮痛状態のラットを用いて、意識レベルを維持した状態での実験条件を確立する。
顎下腺の導管結紮・再解放による唾液腺の再生に伴う機能変化の解析：片側の顎下腺導管を結紮・再解放し、再肥大に伴う機能亢進の過程を明らかにする。またこの実験では、顎下腺の結紮前に組織特異的プロモーター制御型Ca2+センサー遺伝子を唾液腺細胞に発現させ、それらの発現を組織学的に解析する。さらに、遺伝子を発現させた唾液腺を摘出し、酵素処理によって得られた腺房細胞、導管細胞、およびプロジェニター細胞のCa2+応答をin vitroで解析する。
顎下腺の導管結紮・再解放による唾液腺の代償性肥大に伴う機能変化の解析：導管結紮した反対側の顎下腺にCa2+センサーを発現させ、光ファイバー装置を使ってアセチルコリン刺激に対する腺房細胞の反応性の経日変化を観察する。さらに反対側唾液腺の導管細胞およびプロジェニター細胞の自発的反応と薬物反応性をin vivo Ca2+イメージングで解析する。
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| Causes of Carryover |
平成29年3月に実施した実験および実験結果をまとめるための経費の会計処理に時間を要したため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実験結果をまとめるための人件費および実験に必要な消耗品の購入に使用する。
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