2017 Fiscal Year Research-status Report
歯周病原細菌による有臭有毒物質産生を抑制する化合物の探索と改良
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16K11485
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
毛塚 雄一郎 岩手医科大学, 薬学部, 助教 (50397163)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉田 康夫 愛知学院大学, 歯学部, 准教授 (10315096)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 短鎖脂肪酸 / 揮発性硫化物 / Porphyromonas gingivalis / 歯周病 / 口臭 / 酵素構造 / X線結晶構造解析 / 化合物スクリーニング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、口腔内の有臭有毒物質（短鎖脂肪酸と揮発性硫化物）に着眼し、それらの産生源となる歯周病原細菌由来の酵素の解析を進めている。P. gingivalisの短鎖脂肪酸合成に関与するアシルCoA還元酵素（Pgn0723; Yoshida et al., Arch. Biochem. Biophys. 2016）はsuccinyl-CoAとNAD(P)H存在下でsuccinyl semialdehydeを生成し、この酵素遺伝子欠損株は、培養上清中への酪酸、イソ酪酸およびイソ吉草酸の産生が顕著に低下するだけでなく、野生型に比べ高い生育阻害が起こる。したがって、この酵素の阻害剤は、P. gingivalis特異的な抗菌薬や酪酸に起因する口臭の予防薬になり得る可能性を秘めている。昨年度のPgn0723酵素単独の構造決定に加え、Pgn0723/CoA複合体の結晶構造を決定した。基質非存在下においては、推定の基質結合部位を、Leu408を含むループが占めていたが、CoA複合体においては、このループが分子表面まで伸展したことで、基質結合部位には基質を収容する空間ができていた。
口臭の主要な原因物質であるメチルメルカプタンを産生する酵素（Methionine gamma-lyase, MGL）については、探索済みであった新規阻害剤候補化合物の阻害活性を、ガスクロマトグラフィーにより測定した。得られた50%阻害濃度は、これまで用いてきた反応副産物を定量する系とほぼ同等であり、この候補化合物によりMGLのメチルメルカプタン産生が確実に阻害されることが証明された。並行して進めていた硫化水素産生酵素については、成果をまとめ、Biochemical Journalで発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究開始当初より、酪酸合成に関与する酵素ついては、Pgn0723と別の酵素についても、解析を進めた後、その結果を踏まえて、化合物スクリーニングを実施する酵素を決定する見込みであった。しかしながら、別の酵素については、着実に進展はしているものの、キャラクタリゼーションに依然時間を要している。昨年度の研究により、この酵素は、別のタンパク質と共役して働く可能性を見出し、今年度は、共役するタンパク質をほぼ同定した。Pgn0723の研究成果も含め、情報は蓄積されつつあるが、標的タンパク質を決めきれていない点については、計画はやや遅れていると考えている。MGLについては、順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
酪酸合成に関与する酵素については、キャラクタリゼーションを進め、結晶化および回折実験と、スクリーニングに向けた予備実験を並行して実施する。MGLについては、候補化合物を歯周病菌の培養液へ添加した際の硫化水素産生量の変化を確かめる。
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| Causes of Carryover |
研究の遅れにより化合物スクリーニングに使用予定であったライブラリー（試薬）が不要であったこと、劣化が懸念されていたタンパク質精製用カラムの購入を控えたことが、次年度使用額が生じた主な理由である。これらは、研究が進めば次年度必要となる消耗品である。その他、試料調製に必要な試薬やプラスチック消耗品、打合せや学会発表のための旅費に、主に予算を使用する。また、次年度は、実験補助員1名を年間を通して雇用できる見込みであり、謝金にも使用する。
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