2016 Fiscal Year Research-status Report
分子時計遺伝子群を標的とした骨関連疾患治療薬の創出に向けた分子薬理学的研究
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16K11495
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| Research Institution | Aichi Gakuin University |
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Principal Investigator |
平居 貴生 愛知学院大学, 薬学部, 准教授 (80389072)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
浜村 和紀 愛知学院大学, 歯学部, 准教授 (00422767) [Withdrawn]
近藤 久貴 愛知学院大学, 歯学部, 講師 (40469002) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 時計遺伝子 / 骨代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、分子レベルおよび個体レベルの両面から、骨軟骨組織における分子時計の正常な機能と制御に関する知見を収集すること、骨粗鬆症発症における分子時計の関与を明らかにすることを目的に研究を開始した。その中で、本年度は、骨リモデリングにおける時計遺伝子Nuclear Factor, Interleukin 3 Regulated/E4 Promoter-Binding Protein（Nfil3/E4BP4）の新規機能の解明を中心に研究を進めた。時計遺伝子Nfil3/E4BP4は、時計遺伝子Period2を抑制的に制御して概日時計の時刻合わせをする重要な因子であるだけでなく、Nfil3/E4BP4はT細胞の分化決定に必須な転写因子であることが報告されている（Yu et al., Science 2013）。したがって、交感神経シグナルの標的分子として同定した Nfil3/E4BP4の分子時計の骨組織における特異的機能とその分子制御機構を明らかにすることを目的に、Nfil3/E4BP4遺伝子欠損マウス(KO)の表現型の解析に努めた。具体的には、µCT法を用いた骨量の測定、凍結切片またはパラフィン切片標本を用いた形態計測による骨芽細胞数、破骨細胞数の測定、カルセイン二重標識法による骨形成能の測定を行い、Nfil3/E4BP4遺伝子欠損に伴う骨形成、骨吸収への影響について解析した。その結果、Nfil3/E4BP4遺伝子欠損マウスでは野生型マウスに比べてBV/TV値と骨形成パラメーターであるBFR値の減少が明らかとなった。すなわち、Nfil3/E4BP4は骨形成に関与する可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度は、計画通り個体レベルでのNfil3/E4BP4の機能解析を実施した。Nfil3/E4BP4ノックアウトマウスの解析では、骨形成に関与する可能性が示唆されたので、細胞レベルによるNfil3/E4BP4の機能解析のために、骨芽細胞様株MC3T3-E1細胞を用いてNfil3/E4BP4過剰発現安定株を作製し、細胞生物学的解析を行った。その結果、Nfil3/E4BP4過剰発現によってALP活性の有意な増加が観察された。一方、siRNA、リアルタイムPCR法を用いてNfil3/E4BP4のノックダウンの影響について検討した結果、Nfil3が骨代謝関連分子シクロオキシゲナーゼ-2（COX-2/prostaglandin endoperoxide synthase 2）の遺伝子発現を制御し、細胞増殖に影響を及ぼすことが判明した。これまでの結果に関しては、個体レベルおよび細胞レベルの解析で、ほぼ予定通りに進捗していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２８年度に続き、「時計遺伝子群Nfil3/E4BP4の新規機能を解析の解析」について検討する。平成２９年度は、骨芽細胞におけるNfil3/E4BP4の標的遺伝子として、転写調節因子Ppargc1aの新規機能についても順次解析する。すなわち、転写調節因子Ppargc1aの骨組織特異的な新規機能を明らかにするためにCre-loxPシステムを用いた骨芽細胞特異的Ppargc1a遺伝子欠損マウス（Osx-cre:Ppargc1aflox/flox）を作製し、これらマウスの表現型の解析に努める。
また、Nfil3/E4BP4ノックアウトあるいはRNA干渉を用いたノックダウン下における分子カスケードの相違を、DNAマイクロアレイなどを用いて解析し、骨芽細胞における時計遺伝子による制御機構の全体像を明らかにしたい。さらに、時計遺伝子Nfil3/E4BP4→Ppargc1aからその下流分子のカスケードを特定するとともに、その標的分子の骨芽細胞における機能解析を進める。また、骨粗鬆症モデルである卵巣摘出マウスを用いて骨粗鬆症発症時におけると時計遺伝子群の変動と生物作用について追究する。すなわち、卵巣摘出群のマウス大腿骨とSham群を比較して、時計遺伝子Nfil3/E4BP4、Period、Bmal1、Rev-erbの遺伝子について解析し、病態時における時計遺伝子群の関与について検討し、これらメカニズムにおけるNfil3/E4BP4の関与について順次解析する予定である。
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