フィブロネクチンＮ末端断片が結合するCD13の炎症性骨破壊における役割の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K11518
• Research Institution: Meikai University
• Principal Investigator: 天野 滋 明海大学, 歯学部, 准教授 (90167958)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 関根 圭輔 横浜市立大学, 医学部, 助教 (00323569)
• Project Period (FY): 2016-10-21 – 2019-03-31
• Keywords: 破骨細胞 / CD13 / Fibronectin / NGR配列

Outline of Annual Research Achievements

歯周病は歯周病原性細菌によって引き起こされる歯槽骨破壊を伴う慢性炎症である。その歯槽骨破壊は、歯周病原性細菌の菌体成分を認識するToll like receptor(TLR)からのシグナルが、マクロファージからの炎症性サイトカインや骨芽細胞からのRANKL発現を誘導し、破骨細胞分化機能の亢進が引き起こされることによると考えられている。私共は、トリプシン消化によって断片化されたFibronectin Ｎ末端30kDa(Fn30kDa)部分が、破骨細胞前駆細胞上のCD13に結合しRANK、TRAF6、NFATc1、c-Fos遺伝子発現を上昇させ破骨細胞分化を促進させること、また細胞膜上に発現しているCD13が破骨細胞の分化とともに核周囲へ、そして波状縁へと移動していく知見を得た。そこで、歯槽骨破壊におけるFn30kDa/CD13シグナルの役割を検討することは意義あると考え、破骨細胞分化におけるこのシグナルの役割を明らかにすることを目的としている。
Fn30kDaはフィブリン結合部位のモジュールI型部分（1～5）であり、NGR配列が存在するモジュールI型部分５がCD13との結合部位であると推測された。そこで、この５つの部位のビオチン標識ペプチドを作製し、CD13との結合を共焦点顕微鏡によるcolocalization assayによって検討したところ明らかにcolocalizationが認められた。さらにIP Westernによって確認する予定である。
FnI型ドメインは、Fn内部のポリペプチドの繰り返し構造として発見された。つまり、酵素で消化されて切られない限りは、表面に現れてこない部分である。FnI型ドメインで構成されているFn30kDaのCD13結合部位（NGR）を特異的に認識するモノクローナル抗体を、ラットリンパ節法を用いて作製中である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

本研究は、2016年10月末に採択され、速やかに実験準備に取り掛かった。Fn30kDaのCD13結合部位（NGR）を特異的に認識するモノクローナル抗体作製とCRISPR/Cas9システムを用いた破骨細胞前駆細胞4B12細胞のCD13遺伝子ノックアウト細胞作製が、作製途中で完了していない。モノクローナル抗体作製は、ラットリンパ節法を用いFn30kDaを尾根部へ１回免疫して、２～３週間後血液とラット腸骨リンパ節細胞を採取。Fn30kDaのNGR を含むCD13結合部位に対する抗体価測定後、PEGを用いてミエローマ細胞と融合、ELISAスクリーニング、ハイブリドーマのクローニングを行い、モノクローナル抗体を取得する計画である。現在Fn30kDaのNGR を含むCD13結合部位を認識する抗体が、Fn30kDa免疫ラットの血清中から検出されたことから、腸骨リンパ組織細胞とミエローマ細胞SP2/0細胞をPEGで融合させ一次スクリーニング中である。また、破骨細胞前駆細胞4B12細胞のCD13遺伝子ノックアウト細胞作製は、CRISPR/Cas9システムで遺伝子導入クローニングが速やかに成功するように予備実験として、GFPmRNAをAmaxaで遺伝子導入後Cell sorterでGFP陽性細胞を分離クローニングできるか否か検討したところ成功したので、早急にCD1３遺伝子ノックアウト細胞作製を実行する予定である。

Strategy for Future Research Activity

Fn30kDaのCD13結合部位（NGR）を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて、OVXマウス、LPS刺激による骨吸収実験マウス、リュウマチモデルマウスにおいて、消化酵素によって分解されたFibronectin N末端が血液中に存在するか否か明らかにする。
破骨細胞前駆細胞上のＣＤ13は、分化前では細胞膜上に、TRAP陽性多核細胞では核周囲に、そして骨吸収を行っている成熟破骨細胞ではruffled borderにその局在を認めた。そこで、CRISPR/Cas9システムを用いて破骨細胞前駆細胞4B12細胞のCD1３遺伝子ノックアウト細胞を作製し、破骨細胞分化段階におけるCD13の役割を検討する。
Fn分解産物N末端30ｋＤａ刺激によってRANK、TRAF6、NFATc1、c-Fos遺伝子発現が上昇する結果を得ている。CD13は、細胞内ドメインが短いことから細胞外ドメインのペプチダーゼ活性が主な役割で、シグナル伝達には関与していないと考えられていた。しかし、最近、単球膜上のCD13を抗体で架橋すると、細胞内Ca++の上昇が起きERK1/2、JNKそしてp38のリン化を上昇させサイトカイン分泌を誘導すること、また一方でSrc依存的にCD13細胞内ドメインのtyrosineがリン酸化されSrc、FAKそしてERKをリン酸化することが報告された。これらのシグナルに関与している分子は、RANK、TRAF6、NFATc1、c-Fos遺伝子発現に関与していることがすでに証明されているので、Fn分解産物N末端30ｋＤａ刺激がCD13の架橋を誘導して、Src、FAK、ERK1/2、JNK、p38のリン酸化、RANK、TRAF6、NFATc1、c-Fos遺伝子発現へと結びついているか検討する。

Causes of Carryover

Fn30kDaのCD13結合部位（NGR）を特異的に認識するモノクローナル抗体作製で、PEGを用いてミエローマ細胞とFn30kDa免疫ラット腸骨リンパ節細胞の融合を行っているが、スクリーニングの工程でELISAスクリーニングを行う予定である。このスクリーニングのためのペプチド合成、ELISAを行うためのペプチドコーティングキット（タカラ）、発色試薬等を購入する必要がある。また、CD13遺伝子ノックアウト細胞を作製には、gRNAを作製しなければならない。つまり、ELISAスクリーニンのための試薬購入とgRNA作製費用として次年度使用額が生じてしまった理由である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

Fn30kDaのCD13結合部位（NGR）を特異的に認識するモノクローナル抗体作製過程で行うELISAスクリーニングで、ELISAスクリーニングに用いる抗原ペプチド合成、ELISAキット、発色試薬等購入に使用する予定である。
CD13遺伝子ノックアウト細胞作製にに用いるgRNA合成に使用する予定である。