2017 Fiscal Year Research-status Report
唾液エクソソームを用いた唾液腺腫瘍の遺伝子変異多様性解析と悪性度診断法の確立
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16K11524
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| Research Institution | Tokyo Dental College |
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Principal Investigator |
國分 克寿 東京歯科大学, 歯学部, 講師 (90535808)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | エクソソーム / バイオマーカー / DNA / 唾液 / exosome / 腫瘍 / DNA解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、エクソソームが宿主細胞の遺伝情報を含有することに着目し、唾液エクソソームを用いた唾液腺腫瘍の遺伝子変異多様性の解析を目的とする。具体的には、唾液エクソソームからdsDNA(double-strand DNA)を抽出し、そのdsDNAの遺伝子変異情報を元に唾液腺腫瘍の新たな悪性度の診断法を開発する。
本研究では、エクソソーム内にdsDNAが含まれており、それらが親細胞の性質を反映していると仮定し、研究を始めた。まずは概念証明実験として、癌細胞株のエクソソームを用いて実験を行った。エクソソームは超遠心法を用い精製した。その後、エクソソームの確認のため、FACSならびにWestern blottingにてエクソソームマーカーであるCD9、CD63、CD81、TSG101の発現を確認した。精製したエクソソームからDNAを抽出し、BioanalyzerにてDNAのサイズを確認した。また、dsDNAがエクソソームに内包されていることを確認するため、Anti-CD9とAnti-dsDNAの二重染色を行ない、TEM観察を行なったところ、エクソーム内にCD9とdsDNAの共発現が観察された。エクソソーム内のdsDNA が母細胞のDNAの性質を反映しているかどうかを調べるため、腫瘍特異的な遺伝子変異をSanger Sequenceを用いて調べた。その結果、KRAS、NRAS、TP53、MYD88といった様々な親細胞が持つ腫瘍特異的な遺伝子変異を、エクソソームが反映していることが分かった。 次に、親細胞が持つ遺伝子変異をエクソソームがどの程度反映しているかを確かめるため、次世代シークエンサーを用いたwhole exome sequenceを施行したところ、親細胞のDNAとエクソソーム内のDNAが合致していることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
エクソソームに含まれるdsDNAの抽出を行い、その存在を複数の細胞株由来のエクソソームにおいて電子顕微鏡やBioanalyzer、Sanger Sequence、whole exome sequenceを用いて証明することが出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
唾液サンプルを用い、唾液エクソソームにおけるDNAの発現をこれまでに行った方法と同様な方法で検討する。また唾液腺腫瘍特異的な遺伝子変異を手術検体を用いて確認する。
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