Establishment of Analysis of Genetic Diversity and Mutations and Method for Diagnosing Malignancy of Salivary Gland Tumor using Salivary Exosomes

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K11524
• Research Institution: Tokyo Dental College
• Principal Investigator: 國分 克寿 東京歯科大学, 歯学部, 講師 (90535808)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: エクソソーム / バイオマーカー / DNA / 腫瘍 / exosome

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、エクソソームが宿主細胞の遺伝情報を含有することに着目し、唾液エクソソームを用いた唾液腺腫瘍の遺伝子変異多様性の解析を目的とする。具体的には、唾液エクソソームからdsDNAを抽出し、そのdsDNAの遺伝子変異情報を元に唾液腺腫瘍の新たな悪性度の診断法を開発する。
本研究では、エクソソーム内にdsDNAが含まれており、それらが親細胞の性質を反映していると仮定し、研究を始めた。まずは概念証明実験として、癌細胞株のエクソソームを用いて実験を行った。エクソソームは超遠心法を用い精製した。その後、エクソソームの確認のため、FACSならびにWestern blottingにてエクソソームマーカーであるCD9、CD63、CD81、TSG101の発現を確認した。精製したエクソソームからDNAを抽出し、BioanalyzerにてDNAのサイズを確認した。また、dsDNAがエクソソームに内包されていることを確認するため、Anti-CD9とAnti-dsDNAの二重染色を行ない、TEM観察を行なったところ、エクソーム内にCD9とdsDNAの共発現が観察された。エクソソーム内のdsDNA が母細胞のDNAの性質を反映しているかどうかを調べるため、腫瘍特異的な遺伝子変異をSanger Sequenceを用いて調べた。その結果、KRAS、NRAS、TP53、MYD88といった様々な親細胞が持つ腫瘍特異的な遺伝子変異を、エクソソームが反映していることが分かった。 次に、親細胞が持つ遺伝子変異をエクソソームがどの程度反映しているかを確かめるため、次世代シークエンサーを用いたwhole exome sequenceを施行したところ、親細胞のDNAとエクソソーム内のDNAが合致していることが分かった。また、患者の血液サンプルからエクソソーム内のDNAを抽出し、ターゲットシークエンスを行った。

Research Products

• [Journal Article] Platelets Enhance Multiple Myeloma Progression via IL-1β Upregulation (2018)
  • Author(s): Takagi S, Tsukamoto S, Park J, Johnson KE, Kawano Y, Moschetta M, Liu CJ, Mishima Y, Kokubun K, Manier S, Salem KZ, Huynh D, Sacco A, Forward J, Roccaro AM, Battinelli EM, Ghobrial IM.
  • Journal Title: Clinical Cancer Research Volume: 24 Pages: 2430～2439
  • DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-17-2003
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Blocking IFNAR1 inhibits multiple myeloma?driven Treg expansion and immunosuppression (2018)
  • Author(s): Kawano Y, Zavidij O, Park J, Moschetta M, Kokubun K, Mouhieddine TH, Manier S, Mishima Y, Murakami N, Bustoros M, Pistofidis RS, Reidy M, Shen YJ, Rahmat M, Lukyanchykov P, Karreci ES, Tsukamoto S, Shi J, Takagi S, Huynh D, Sacco A, Tai YT, Chesi M, Bergsagel PL, Roccaro AM, Azzi J, Ghobrial IM.
  • Journal Title: Journal of Clinical Investigation Volume: 128 Pages: 2487～2499
  • DOI: 10.1172/JCI88169
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Inhibition of microRNA-138 enhances bone formation in multiple myeloma bone marrow niche (2018)
  • Author(s): Tsukamoto S, Lovendorf MB, Park J, Salem KZ, Reagan MR, Manier S, Zavidij O, Rahmat M, Huynh D, Takagi S, Kawano Y, Kokubun K, Thrue CA, Nagano K, Petri A, Roccaro AM, Capelletti M, Baron R, Kauppinen S, Ghobrial IM.
  • Journal Title: Leukemia Volume: 32 Pages: 1739～1750
  • DOI: 10.1038/s41375-018-0161-6
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Congenital Epulis: A Case and Review of the Literature (2018)
  • Author(s): Kokubun Katsutoshi、Matsuzaka Kenichi、Akashi Yoshihiko、Sumi Masami、Nakajima Kei、Murakami Satoshi、Narita Masato、Shibahara Takahiko、Inoue Takashi
  • Journal Title: The Bulletin of Tokyo Dental College Volume: 59 Pages: 127～132
  • DOI: 10.2209/tdcpublication.2017-0028
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Profiling of circulating exosomal miRNAs in patients with Waldenstr?m Macroglobulinemia (2018)
  • Author(s): Bouyssou JM, Liu CJ, Bustoros M, Sklavenitis-Pistofidis R, Aljawai Y, Manier S, Yosef A, Sacco A, Kokubun K, Tsukamoto S, Perilla Glen A, Huynh D, Castillo JJ, Treon SP, Leblond V, Hermine O, Roccaro AM, Ghobrial IM, Capelletti M.
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 13 Pages: e0204589
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0204589
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 上顎洞に発生した ALK 陽性未分化大細胞リンパ腫の一例 (2018)
  • Author(s): 中條 貴俊, 明石 良彦, 根本 淳, 小谷地雅秀、中島 啓, 國分, 克寿, 橋本 和彦, 菅原 圭亮, 松坂 賢一, 井上 孝
  • Organizer: 第２９回日本臨床口腔病理学会・第１１回日本口腔検査学会総会共催学術大会
• [Presentation] 顎骨内のリンパ増殖性病変が診断の契機となったIgG4関連疾患の一例 (2018)
  • Author(s): 中島 啓, 中條 貴俊, 鷲見 正美, 明石 良彦, 國分 克寿, 橋本 和彦, 佐々木 文, 冨田 茂樹, 松坂 賢一, 井上 孝
  • Organizer: 第107回日本病理学会
• [Presentation] ラット唾液腺創傷部に入れたマトリゲルの影響 in vivoからin vitroでの検討 (2018)
  • Author(s): 金内 洋光, 小林 史卓, 遠藤 多加史, 外村 岳央, 明石 良彦, 鷲見 正美, 根本 淳, 中條 貴俊, 矢野 尚, 中島 啓, 國分 克寿, 村上 聡, 松坂 賢一, 井上 孝
  • Organizer: 第305回東京歯科大学学会
• [Presentation] FGF7はラット唾液腺創傷治癒における幹細胞の細胞増殖と分化を促進させる (2018)
  • Author(s): 遠藤 多加史, 小林 史卓, 金内 洋光, 外村 岳央, 明石 良彦, 鷲見 正美, 根本 淳, 中條 貴俊, 中島 啓, 矢野 尚, 國分 克寿, 村上 聡, 松坂 賢一, 井上 孝
  • Organizer: 第305回東京歯科大学学会