2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K11527
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
小林 良喜 日本大学, 松戸歯学部, 助手(専任扱) (10609085)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 歯周病モデルマウス / 自然リンパ球 / Innate Lymphocyte Cell |
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯周疾患は歯周病原性細菌と宿主細胞との相互作用により歯周組織の破壊が引き起こされる慢性炎症性疾患であり、生体は細菌に対する防御反応として様々な免疫応答を有している。近年報告された自然免疫機構に関わる新たな細胞群として自然リンパ球 (Innate Lymphocyte Cells; ILCs)がある。ILCsは生体恒常性に関わり、アレルギーや炎症誘発、慢性化の誘導に関与することが報告されている。本研究では歯周病原性細菌による歯周炎の誘発や慢性化に至る機序をILCsの動態を中心として、申請者らが確立した歯周病モデルマウスを応用して行った。
歯周炎モデルマウスを構築するためにマウス（BALB/c 雌 ７週齢）に10e8 CFUの歯周病原性細菌 (Porhyromonas gingivalis; Pg菌)の口腔内接種を行い、擬似接種マウスを対照群とした。 Pg菌の最終経口接種から1日、7日、15日、30日後に安楽死させ、口腔粘膜固有層から単核細胞を単離し、蛍光標識抗体を用いてILCsの動態について継時的変化をフローサイトメトリー法により検討したところ、対照群と比べて継時的な変動を認めた。次いで、ILCsの分化誘導に関わる各種サイトカインの産生を歯肉組織や歯肉粘膜固有層に局在する樹状細胞にて検討したところ、歯肉炎症巣に局在する樹状細胞からIL-12やIL-23 mRNAは対照群と同程度か、認める事はできなかった。しかしながら炎症歯肉組織からIL-33 mRNAの発現を認めた。これらの結果から、歯周病原性細菌による惹起された歯周炎症巣には type2 ILCが集積し炎症応答が惹起されることが考えられる。 今後はILCsから産生されるサイトカインを検討する事でtype2 ILCであることを検証し、さらにPg菌の感染により惹起されることを病原因子欠損株を用いる事で検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度は歯肉粘膜固有層からILCを検討するにあたり蛍光標識抗体の組み合わせを検討したが、細胞数が少ないことからセルソーター等で単離することが困難であると予想し、ILCsの分化誘導に関わる歯肉炎症巣に局在する樹状細胞や歯肉組織からtotal RNAを採取し、ILCの分化誘導に関わるサイトカインの発現レベルを検討することで歯肉炎症巣に局在するILCsの分類を試みた。
歯肉炎症巣に局在する樹状細胞からはIL-12やIL-23は対称群と比べて有意に認めることができなかった。他方、炎症歯肉組織からIL-33 mRNAの発現を認めることができた。
このことから、歯肉炎症巣においてType2 ILCの分化誘導が考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの結果より、歯肉炎症巣に局在するILCはtype2であることが示唆された。最終年度はILCの分類を検討するために、歯肉炎症巣からセルソーター等によりILCを単離し、採取したtotal RNAからIL-13やIFNg、IL-17, IL-22の発現レベルと比較する。サイトカインの発現を比較検討し、また、分化誘導に関わる樹状細胞や歯肉組織から発現されるサイトカインと比較することでILCの分類を行う。さらに、歯周病原性細菌により歯肉粘膜固有層に局在することを確認するために、病原因子（線毛やジンジパイン）の欠損株を用いることで特異性を検討する。
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| Causes of Carryover |
（理由）歯肉炎症巣におけるILCの動向を検討するために、セルソーターシステム (FACSaria, 共用機器) を用いて採取を行なったが蛍光標識抗体の検討や使用時間の確保や、得られた細胞数が少なくリアルタイムPCR法に供する困難であったことから計画に遅れが出た。
（使用計画）平成28、29年度の結果から、歯肉炎症巣に局在するILCの動向や分化誘導する歯肉上皮や樹状細胞の動向についても把握することができた。最終年度はこれまでに得られた結果の再現性を確認するために、サイトカインの発現レベルをリアルタイムPCR法等のを用いて検討する。また、歯周病原性細菌に特異的な応答であることを検討するために病原因子欠損株の口腔内接種を行い、ILCの動向を検討するために、動物（マウス）や蛍光標識抗体、PCR試薬の購入に充て、これまでに得られた結果を誌上発表を行うための論文校正および投稿料に充てる。
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Research Products
(1 results)
