2016 Fiscal Year Research-status Report
神経―癌細胞間クロストークの解析：口腔癌細胞による神経新生誘導と末梢神経浸潤
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16K11529
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| Research Institution | The Nippon Dental University |
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Principal Investigator |
添野 雄一 日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (70350139)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
島津 徳人 麻布大学, 生命・環境科学部, 准教授 (10297947)
田谷 雄二 日本歯科大学, 生命歯学部, 准教授 (30197587)
白子 要一 日本歯科大学, 生命歯学部, 助教 (50756377)
佐藤 かおり 日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (90287772)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 病理学 / 腫瘍 / 扁平上皮癌 / 神経浸潤 / 神経新生 / 遺伝子発現 / 同所移植モデル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
口腔癌の疼痛については、癌細胞の浸潤に伴う神経組織の圧迫や能動的な神経組織環境への指向など、複雑な機序が想定されている。本研究では、口腔癌細胞と末梢神経線維との相互作用の解明を長期目標として、癌細胞の神経浸潤および神経新生誘導について舌癌動物モデルを用いた病理形態解析を行う。
初年度の今回、ヒト口腔癌由来細胞株HO-1-u-1をヌードマウスの舌組織へ移植し、得られた癌組織の形態学的特徴を解析した。HO-1-u-1は、予備検討での観察期間（移植後～30日間）において神経浸潤傾向を示した。したがって、まずは神経浸潤に至る癌組織の成り立ちを調べる目的で、最大組織割面に相当するパラフィン包埋試料から薄切切片を作成し、癌形質マーカー（サイトケラチン、ビメンチン）、神経マーカー（ニューロフィラメント；NFP）の多重免疫染色を実施して周囲間質要素を含めた癌組織の形態観察を行った。HO-1-u-1移植の初期段階（移植後7～14日間）では、目視による舌表面の観察で腫瘍塊を認めなかったが、採取した舌試料のHE組織観察によって移植部に癌細胞の小集塊を見出すことができた。癌組織塊からは、癌細胞が3～10細胞程度連なって基質成分の乏しい舌筋線維の間隙を放射状に進行する様子を認めた。この浸潤先端部では上皮細胞骨格のサイトケラチンと間葉細胞骨格のビメンチンの二重陽性を示すHO-1-u-1が占めていた。連続薄切切片の多重免疫標識・組織立体構築では、舌中央付近の右側縁部に注入移植したHO-1-u-1細胞が舌下神経（舌根部から舌尖方向に向かって走行）の分枝に沿って局在している様子も捉えられた。これらの観察から、HO-1-u-1は上皮―間葉の中途形質で組織破壊能が弱い性質により、進展過程において基質の乏しい筋線維間、神経線維周囲隙に沿って進行していると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マウス舌組織中の癌細胞の挙動、癌伸展に伴う神経組織との相互作用を組織観察に基づいて検証するうえでは、癌微小環境の多要素について位置情報を高精度に維持して再現・解析することが鍵となる。我々の研究グループでは、これまでの科研採択課題において、画像処理法（バーチャルスライドデジタル画像記録→NIH ImageJとRATOC TRI-SRF2ソフトウェアによる画像統合処理）を用いて異なる細胞表現型を示す腫瘍実質と間質要素（血管内皮、リンパ管内皮、筋線維芽細胞等）を分画する手法を確立してきた。本研究課題もこの手法を用いた多要素解析を主軸として計画を立案している。当初計画では、神経浸潤時の癌細胞の表現型変化に加え、癌細胞―神経の接点の詳細解析や神経新生の検索を予定していたが、実際の作業内容として、各種抗体の特性と染色条件（特に癌細胞形質マーカーと神経線維マーカーの同時検出条件）についての再検討を優先し、検出条件の安定化を図った。HO-1-u-1移植試料についても予備検討で得られた神経浸潤所見の観察頻度を再確認し、計画が遂行可能であるとの確証を得ることができた。神経組織要素の細分化を目指したサブユニット分子NF-H (200 kD), NF-M (160 kD), NF-L (68 kD)の各抗体による多重染色については、染色条件の検討段階にあるが、これらの要素を複合した解析は実現可能と見積もっている。このほか、連続薄切標本の解析では、4μm厚、200枚の組織切片の多重標識・3次元組織構築により癌胞巣とその内外間質空間を走行する神経を捉えることも達成した。神経線維に沿う癌細胞について、移行的な形質がみられるかどうかを確認するうえでは、割断を縦断方向に設定する工夫も可能と考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度では、癌―神経浸潤部の詳細な構造解析を継続するとともに、HO-1-u-1の神経親和性に関わる分子発現について解析を開始する。癌細胞と神経との相互作用の検証を目的とする移植実験では、舌尖、舌根、および口底の各部位に微量のHO-1-u-1細胞懸濁液を注入、移植後2,4,6,8週間で舌～口底部組織を採取する（白子・田谷分担）。癌細胞形質の免疫染色として、サイトケラチン、ビメンチン、Eカドヘリン、CD44、および軸索誘導に関わるNetrinを予定する。神経新生に関しては、神経骨格サブユニットの多重標識にて検証する（NF-L；神経新生の指標、NF-H；成熟神経の指標）。3次元形態計測に基づく新生神経の定量情報を検証する目的で、腫瘍塊をホモジナイズし、NFPサブユニット抗体を用いたウェスタンブロットを行う（添野分担）。唾液腺組織が介在する舌根部と口底部では特に交感神経マーカー（tyrosine hydroxylase; TH）、副交感神経マーカー（vesicular acetylcholine transporter; VAChT）の二重標識も計画する。分子発現解析に向けては、直径2 mm程度に増生したHO-1-u-1腫瘍塊（移植後約4週）を切除・分離し、遺伝子発現解析（マイクロアレイ）を実施する（佐藤分担）。神経細胞への作用（増殖・分化誘導能）を確かめる目的では、ケモタキシスチャンバーを用いて、神経前駆細胞PC12（ラット褐色細胞腫由来；NGF刺激により分化する）とHO-1-u-1との共培養を実施し、神経細胞の変化を観察するとともに癌細胞の移住能を測定する（田谷分担）。培養後の細胞は固定後免疫染色にて表現型を確認するとともに、マイクロアレイを実施し、アレイデータのIPA解析により共培養で発現変動を来したシグナルカスケードを同定する。
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| Causes of Carryover |
当初計画では、癌細胞―神経の接点の詳細解析や神経新生の検索を予定していたが、検出条件の安定化を図る目的で、各種抗体の特性と染色条件（特に癌細胞形質マーカーと神経線維マーカーの同時検出条件）についての再検討を優先した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
計画していた神経サブクラス別のマーカー検出条件設定および生化学的分析を実施するため、免疫組織化学に必要な特異抗体および関連試薬、タンパク発現解析用試薬、その他細胞培養に要する消耗品経費として使用する。
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