口腔扁平上皮がんの上皮間葉移行と浸潤能にpodoplaninがどう関与するのか

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K11532
• Research Institution: Aichi Gakuin University
• Principal Investigator: 後藤 満雄 愛知学院大学, 歯学部, 講師 (60645191)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野本 周嗣 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (40300967) ; 中西 速夫 愛知県がんセンター(研究所), その他部局等, その他(移行) (20207830)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 口腔扁平上皮癌 / 上皮間葉移行 / Podoplanin / 抗体

Outline of Annual Research Achievements

当該年度の主な研究計画は、TGF-β受容体/Smadシグナルを介したPodoplaninの浸潤能におけるRap1の関与を検討し、この経路に伴う上皮間葉移行（EMT）マーカーとMMPの発現と転写活性の変化を解明することであった。予備実験において、TGF-βを投与することによりUMSCC81B細胞株を含めた複数の口腔扁平上皮癌(以下OSCC)細胞株においてPodoplanin発現の増強を認めた。この変化はSmad2のリン酸化の増加に並行して認めた。反対に、TGF-βtype I受容体阻害剤は、Podoplanin発現をタンパクレベルとmRNAレベルで抑制した。また、TGF-βはEMTを誘導し、E-cadherinの発現抑制とvimentinの発現増強を認めた。この結果をふまえて、Podoplaninの発現と浸潤能に対してRap1がどのように関与するかをin vitro系で検討中である。
一方、in vivo実験としては上記の結果からPodoplaninのブロックがEMTを抑制し、従ってOSCCの浸潤転移の抑制に繋がることが予想されたため、Podoplaninが治療ターゲットとなり得るか否かの予備的検討を行った。分子標的薬としてはPodoplanin抗体を用い、まずこれがマウス皮下（皮内）腫瘍に特異的に集積するか、またどのくらいの期間持続するかなどの体内動態をICG標識Podoplanin抗体と遠赤外線蛍光イメージング法を用いて検討した。その結果、OSCC細胞株の中でPodoplanin発現の高いUMSCC81B細胞が低発現のCa9-22細胞染色に比べてPodoplaninの高い集積を認め、しかもこの集積は１週間以上持続した。この結果より、Podoplanin高発現の扁平上皮癌に対して、抗Podoplanin抗体が抗腫瘍効果や治療効果予測因子として期待できる可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

多数のOSCC細胞株とOSCC組織標本を用いてPodoplaninの発現を比較検討した結果、高分化型OSCC細胞株に比べ低分化型OSCC株で浸潤性が高いこと、低分化型でEMT形質を有するOSCC細胞株であるUMSCC81B細胞がPodoplaninを高発現すると同時に、がん幹細胞マーカーも高発現し、マウス実験モデルとして適していることを確認した。そこで、このUMSCC81B細胞株を用いてPodoplaninの発現抑制（ノックダウン）を行ったところ、E-cadherinや角化マーカーであるCK13の発現上昇など分化の促進と増殖抑制を示唆する結果を得た。また本年度行ったICG標識Podoplanin抗体を用いたマウスによるin vivo実験の結果と合わせて評価をすると、OSCC、中でも浸潤転移能が高く、高悪性度の低分化型OSCCに関してPodoplaninが診断、治療の有望なターゲットになる可能性を示唆する結果を得た。以上のことから、本研究は順調に進展していると考えている。
今後も、引き続き研究実施計画に基づいて検討を行う予定である。

Strategy for Future Research Activity

現在までの進捗状況をふまえて、以下のごとく今後の研究を進めて行く予定である。
1)当該年度の実施計画で十分遂行できなかった、Podoplaninの発現変化に伴う癌細胞の増殖と浸潤能の変化に対して、Rap1がどのように関与するかを引き続きin vitro実験で検討して行く。2)細胞株を用いたin vitro実験において、扁平上皮癌細胞の分化によってPodoplaninの発現の違いを認めたことより、その発現変化に対してエピジェネティクスの関与（DNAメチル化異常など）を認めるかどうかを検討する。3)in vivo実験において、マウスに投与したICG標識Podoplanin抗体がPodoplaninを高発現する移植腫瘍に特異的に集積する観察結果を得たことより、抗Podoplanin抗体投与により腫瘍縮小効果が認められるかどうかを検討する。4)研究実施計画にある外科切除材料を用いた検討も予定する。

Causes of Carryover

理由：当該年度の研究実施において、当研究施設に既存している設備を使用した実験が多かった。それに伴い、設備備品費の未使用額が発生した。消耗品費に関しては、前年度の未使用額が多かったこと、必要回数が予想より少なかったこと、既存の消耗品も使用して実験を行ったことが挙げられる。また、当該年度に予定していた研究計画の中で、遂行できなかったin vitro実験分に関しての未使用額が発生したことも理由に挙げられる。
使用計画：次年度に計画している研究、ならびに当該年度に達成できなかった研究を、適正かつ効率的に研究費を使用しながら研究計画書に基づいて進めて行く。次年度は、マウスなどのin vivo治療実験のための抗体や試薬、マウスなどの消耗品材料と器材などの設備備品の購入と既存備品の修理などが増えることが予想されるために、当該年度の未使用額と合わせて適正かつ効率的に利用して行く。

Research Products

• [Presentation] Podoplanin Expression and Its Preclinical Application for Near-Infrared Imaging for Oral Squamous Cell Carcinoma (2017)
  • Author(s): Goto M, Ito A, Miyachi H, Ochiai S, Saito T, Watanabe S, Miyabe S, Yamamoto S, Nomoto S, Nakanishi H, Shimozato K
  • Organizer: The 99th American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons Annual Meeting, Scientific Sessions and Exhibision
  • Int'l Joint Research