2018 Fiscal Year Research-status Report

温度制御式反復温熱刺激による効率的かつ汎用的な神経細胞分化誘導法の開発

Research Project

Project/Area Number	16K11643
Research Institution	Tohoku University
Principal Investigator	工藤忠明東北大学, 歯学研究科, 助教 (50431606)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	望月研太郎東北大学, 医学系研究科, 大学院非常勤講師 (20633499) [Withdrawn] 野口拓也東北大学, 薬学研究科, 准教授 (20431893) 冨並香菜子東北大学, 歯学研究科, 大学院非常勤講師 (10815351) 出江紳一東北大学, 医工学研究科, 教授 (80176239) 金高弘恭東北大学, 歯学研究科, 准教授 (50292222) [Withdrawn] 高木敏行東北大学, 流体科学研究所, 教授 (20197065) [Withdrawn]
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2020-03-31
Keywords	PC12細胞 / サブクローニング / 温熱刺激 / 神経細胞分化 / 骨形成タンパク質 / 神経成長因子
Outline of Annual Research Achievements	我々は温度制御式反復温熱刺激(TRTS)依存性にラットPC12細胞の神経突起伸長を誘導する方法を見出した（工藤ら、2015年）が、TRTSによる神経細胞分化率には改善の余地がある。本年度研究では、これまでの研究結果を踏まえ、(1)TRTS高感受性細胞株及び非感受性細胞株の樹立を目的とする実験を行った。またこれら新規樹立細胞株を活用し、実用性や汎用性向上の観点からTRTSにより活性化されるシグナル経路も検討した。[方法](1)培地に播種したPC12細胞やそのサブクローンに、TRTS処理（9時間×2回/日、7日間）を実施し、その後細胞増殖や神経突起形成を評価した。またBMP4やNGFによる新規細胞株の分化率も評価した。（２）TRTS高感受性PC12細胞株及びTRTS非感受性PC12細胞株をPC12親細胞株からそれぞれサブクローニングするため、96穴プレートを用いた標準的手法によりクローニングをした。[成果]（１）TRTSを用いた分化誘導実験において、樹立細胞株の神経突起伸長により分化率を評価したところ、高感受性細胞株は、親細胞株より分化率が高いことが示された。一方非感受性細胞株はTRTSによる分化率が極めて低かった。（２）代わりにBMP4を添加し分化誘導したところ、TRTSにより分化誘導した際と同じく、高感受性細胞株は親株と同様にBMP4により神経突起を伸長させたが、非感受性細胞株はTRTSを負荷した際と同様、神経突起を伸長させた細胞がほぼ存在せず、BMP4に対しても低い感受性を呈した。（３）更に代わりにNGFを添加したところ、高感受性細胞株と非感受性細胞株はそれぞれ親株と同様、神経突起を伸長させた。但し分化率は、高い順に、高感受性細胞株、親細胞株、非感受性細胞株であった。以上より、PC12細胞におけるTRTS依存性神経細胞分化には、BMPシグナル経路が必要なことが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度研究では、温度制御式反復性温熱刺激（TRTS）を適用して、PC12細胞株から、TRTS高感受性細胞株およびTRTS非感受性細胞株をはじめて樹立した。またこれら新規細胞株を活用して、TRTS依存性神経細胞分化のメカニズムに関する一定の知見を得ることができた。これらの結果を受け、今後は得られた知見に関してさらに実験的検討を重ねるとともに、予定している他の項目の検討も実施する予定である。
Strategy for Future Research Activity	今後の研究の推進方策として、これまでに実施した実験により得られた成果を踏まえ、実験系におけるTRTSの負荷条件を必要に応じてさらに改善しつつも、本研究課題の趣旨に則り以下の検討を実施する。（1）細胞によりTRTSの感受性が大きく異なる結果がこれまでに得られていることから、その要因について引き続き検討する。この目的のため、この度新規に樹立したTRTS高感受性細胞株およびTRTS非感受性細胞株をさらに活用し、TRTSにより活性化され神経突起伸長を誘導するシグナル経路についての検討を継続して実施する。このTRTS依存的なシグナル伝達経路を明らかにすることを通じて、TRTS依存性神経細胞分化における分化誘導効率の向上やそれに伴うTRTSの実用性の向上にも役立てる。（2）これまでに検討した細胞株の他に、さらに順次他の神経細胞分化モデルを用いて、引き続きTRTSにより神経細胞分化誘導可能な条件の検討を行い、TRTSによる神経細胞分化誘導技術の汎用性を検討する。