2016 Fiscal Year Research-status Report
同種再生軟骨に対する細胞免疫機構の解明とスーパーアログラフトの有用性検証
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16K11678
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
浅輪 幸世 東京大学, 医学部附属病院, 特任助教 (10769912)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西澤 悟 東京大学, 医学部附属病院, 特任助教 (00646200)
星 和人 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (30344451)
疋田 温彦 東京大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (60443397)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 再生軟骨 / アログラフト / 細胞外基質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
口腔外科の主要な対象疾患である口唇口蓋裂の治療においては、すでに自家再生軟骨が導入されている。しかし、再生組織の汎用化を目指すためには、同種再生軟骨（アログラフト再生軟骨）の開発が不可欠である。本研究では、アログラフト再生材料に対する免疫反応を詳細に解析し、細胞外基質の成熟や軟骨細胞分化の最適化を図り、免疫寛容性の高いスーパーアログラフト再生軟骨を作製する。得られたスーパーアログラフト再生軟骨による知見は、口腔外科・整形外科領域の軟骨・骨再生のみならず、移植医療に対して新技術、新概念が提示できると考える。
本研究では、生体軟骨基質の免疫寛容の機序を各T細胞の発現傾向、動的挙動を評価し、抗原提示細胞の樹状細胞やマクロファージとの相互作用を組織学的やプロテオーム解析を行うことにより、軟骨基質における免疫寛容の概要を明らかにする。さらに、軟骨組織を構成成分毎に分別し、各軟骨構成成分に対する免疫応答や免疫寛容の網羅的スクリーニングのデータをもとに、in vitroで軟骨基質、細胞成分の分化段階的な免疫応答性を詳細に評価する。以上の検討より、移植後の免疫寛容を誘導する制御機序を解明し、より免疫寛容性の高いスーパーアログラフトが可能な再生軟骨を作製する培養方法を確立する目的として、初年度は、各軟骨構成成分に対しての免疫応答性およびアログラフトに適した基質と細胞成分のin vitro再構築と免疫寛容の誘導を検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アログラフトに適した基質を検討するため、まずin vitroで軟骨基質を作製した。ヒト耳介軟骨細胞を採取、単離し、アテロコラーゲンに包埋後、3次元培養を行い、増殖培地、分化培地で比較を行った。十分な基質の産生を確認した後、再生軟骨の脱細胞化処理を行った。軟骨基質の調整方法は、、物理的処理（凍結融解法）と化学的処理（界面活性剤法）を検討したが、化学的処理（界面活性剤法）の物理的振動を施行することにより、低サイクルで軟骨組織からの細胞の脱核を認め、GAG量も維持することが可能であり、明らかな構造的な破壊なく細胞のみを取り除くことに成功した。次に、作製した脱細胞化再生基質をEGFPマウス、免疫不全マウスの背部皮下に移植し、免疫反応性を検討した。基礎培地で培養した細胞による再生基質と液性因子を添加した増殖培地および分化培地で培養した再生基質を比較すると、軟骨関連因子を添加した培地で培養した細胞により作製された再生基質のほうが、GAGの蓄積が多く、EGFPマウス、免疫不全マウスに移植後も再生基質は維持される傾向を示した。しかし、ホスト側からの細胞侵入性には顕著な違いは認められなかった。併行して、細胞成分に対する免疫応答性を検討するため、ビーグルの耳介軟骨組織を採取し、軟骨細胞を単離し、異なる培養期間（短期、長期）で単層培養を行い比較を行った。どちらの培養細胞もタイプⅡコラーゲンの遺伝子発現は低値を示したことから、培養による脱分化が生じていることが確認された。これらの細胞をヌードマウスの背部皮下に移植を行ったところ、長期間培養した培養軟骨細胞のほうが、再生軟骨が広範囲に観察され、培養期間による細胞状態が移植後の軟骨形成に影響を及ぼすことが示された。
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| Strategy for Future Research Activity |
生体内の成熟組織由来の軟骨基質成分に対しての免疫応答性を検討する。再生軟骨基質の免疫応答活性を評価するため、EGFPマウスの背部皮下に移植を行い、反応する免疫細胞の挙動を解析する。in vitroで成熟、分化程度の異なる軟骨基質と細胞を作製し、免疫獲得の誘導能を検討する。。軟骨構成成分・要素の免疫原性を明確にするため、ヒト耳介軟骨細胞を用いて最適な脱細胞化再生基質と骨髄液より単離したBMSCを用いて最適な分化誘導を行った軟骨細胞を組み合わせることにより、アログラフトに最適な作製方法を検討する。
併行して、アログラフトにおける軟骨構成成分に対しての免疫関連細胞の挙動が明らかになった上で、in vitroで成熟、分化程度の異なる軟骨基質と細胞を作製し、免疫獲得の誘導能を検討する。培養期間は、1（短期）、3（中間期）、6週間（長期）培養を行うことにより、未熟な基質ら成熟した基質まで段階的な軟骨基質を作出する。成熟度の異なる再生基質は、脱細胞化処理を行い、CAG-EGFPマウス（6週齢、雄）の背部皮下に移植を行う。移植3,7,10日後に回収し、EGFP陽性レシピエント細胞を確認後、基質構造と免疫応答細胞との関連性を検討する。
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| Causes of Carryover |
免疫組織学的に白血球全般マーカーであるCD45抗体、抗原提示細胞のマクロファージマーカーであるF4/80、CD68、CD11b、MAC-2抗体、樹状細胞マーカーであるCD11c、CD83、fascin抗体、免疫寛容を担う制御性T細胞（Treg）マーカーであるCD4、CD25、FoxP3抗体を用いて、代表的な免疫応答細胞の挙動、経時的な発現パターンを解析し、網羅的なスクリーニングを行う予定であったが、ビーグル細胞に特異的な抗体がほとんどなかったため。
加えて、IL-2, TNFα,IFNγなどの各種炎症性サイトカインの抗体アレイを用いて網羅的なプロテオーム解析をするために、外注を予定しているため初年度よりも予算を消費する予定である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
免疫染色用の抗体ではなく、ELISAで検討する予定である。
脾臓細胞と基質および細胞成分との共培養を行い、BrdU増殖アッセイによるEGFP陰性T細胞の増殖活性を評価する。さらに、共培養3日後の脾臓細胞におけるリンパ球サブセットをフローサイトメトリーで解析しT細胞を同定する。共培養後の培地は、IL-2, TNFα,IFNγなどの各種炎症性サイトカインの抗体アレイを用いて網羅的なプロテオーム解析を行い、基質と細胞成分に対する免疫応答細胞の関連性を明らかにし、基質成分、細胞成分の免疫獲得に必要な構成成分の同定を行う。
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Research Products
(1 results)
