2016 Fiscal Year Research-status Report
iPS細胞由来神経堤細胞が軸索再生に及ぼす効果と作用機序の解明
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16K11703
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
鳥海 拓 日本大学, 歯学部, 助教 (40610308)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
本田 雅規 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (70361623)
磯川 桂太郎 日本大学, 歯学部, 教授 (50168283)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 神経堤細胞 / ヒトiPS細胞 / 末梢神経再生 / 下歯槽神経損傷 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
口腔外科領域では、外傷や手術により末梢神経が損傷されることも少なくない。本研究では、人工多能性幹細胞（iPS細胞）から分化誘導された神経堤細胞を末梢神経損傷部へ移植することで、末梢神経再生への効果と作用機序を解明することを目的とした。
はじめに、Bajpaiらの方法を応用し、ヒトiPS細胞から神経堤細胞へと分化誘導させ、その細胞学的特性を検討した。誘導された細胞は神経堤細胞マーカー遺伝子（PAX3, P75, SLUG, SNAILおよびSOX9）を発現し、それらはiPS細胞と比較して有意に高かった。蛍光抗体法で、神経堤細胞マーカーであるAP2-α、NESTINおよびP75に陽性、未分化マーカーであるSSEA-4には陰性を示した。加えて細胞表面抗原解析でも、P75は97.5%, HNK-1は27.3%が陽性、23.8%がP75/HNK-1共陽性を示し、SSEA-4には陰性を示した。また、誘導された細胞はコロニーを形成し、自己複製能を有した。次に、誘導された細胞をin vitroで骨芽細胞およびシュワン細胞へ分化誘導したところ、これらの系譜への分化が認められた。さらに、誘導された細胞をブタ歯胚上皮と組み合わせてヌードラットへ移植し、in vivoでの組織形成能を検討したところ、骨および軟骨組織が観察された。これらの組織切片を免疫組織化学で検討したところ、骨芽細胞、骨細胞および軟骨細胞は抗ヒト核抗体に陽性を示した。これまでの結果より、ヒトiPS細胞から神経堤細胞へと分化誘導された細胞は神経堤細胞の特性を有することがわかった。
また、移植実験の足場となる中空性担体には細胞が生着することを確認しており、ラット下歯槽神経切除モデル作製の手技も確立できた。ヒトiPS細胞由来神経堤細胞が末梢神経再生にどのような影響を及ぼすのか、今後の移植実験結果が期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
移植細胞として使用するヒトiPS細胞から分化誘導した神経堤細胞の評価は、当初、神経堤細胞マーカーの免疫抗体法および細胞表面抗原解析の2種を実施する予定であった。しかし、神経堤細胞は本研究課題の核となるため、さらに詳細な細胞学的特性の検討が必要であると判断した。そこで上記2種の解析以外にも、リアルタイムPCRによる神経堤細胞マーカーの遺伝子発現解析、細胞増殖能、コロニー形成能および多分化能解析を実施した。その結果、誘導された細胞は神経堤細胞の特性を有することが示された。計画以上の検討を実施したため、in vitroでのラットシュワン細胞と神経堤細胞との共培養実験は次年度に繰り越すこととなったが、ヒトiPS細胞から分化誘導した神経堤細胞の細胞学的特性をInduction of neural crest cells from human dental pulp-derived induced pluripotent stem cells. Biomed Res. 2017 in press として論文にまとめることができた。また、次年度以降に移植実験で使用する予定であるラット下歯槽神経切除モデル作製の手技も確立できた。以上のことより、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画通り、in vivoでのラット下歯槽神経切除モデルへの移植実験を中心に進めていく予定である。そして摘出した試料から作製したパラフィン切片を用いて、組織学的および免疫組織化学的検討を行う。中空性担体中央部での横断切片において、ヒトiPS細胞由来神経堤細胞の同定として抗ヒトミトコンドリア抗体を使用すると同時に、抗S-100抗体、抗GFAP抗体および抗NF-200抗体で免疫染色を実施し、神経堤細胞移植群とコントロール群とでその発現を比較する。加えて、準超薄切片を作成し、トルイジンブルーで染色された髄鞘を基に、再生軸索数の比較も検討している。
また平成28年度に実施予定であった、in vitroでのヒトiPS細胞由来神経堤細胞とラットシュワン細胞との共培養実験により、神経堤細胞がラットシュワン細胞に与える影響についても同時に検討する。
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Research Products
(2 results)
