Analysis of tissue conversion to specialized mucosa during the lingual papillae development

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K11767
• Research Institution: The Nippon Dental University
• Principal Investigator: 吉村 建 日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 准教授 (90297953)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 舌粘膜 / RNA干渉 / in vivo / マウス

Outline of Annual Research Achievements

これまでに得られたマウス胎仔舌粘膜組織マイクロアレイ解析（本学現有GenspringGX使用）より、舌粘膜乳頭形態形成に関与する転写因子候補３つを選定した。併せてin situ hybridization (ISH)法におけるE14.5胎仔のmRNAの組織内発現画像データベース（http://www.eurexpress.org/ee/）の舌粘膜の局在確認を行った。３種類の転写因子に対して、in vivoのRNA干渉による組織および関連遺伝子の変化に対する影響を解析する目的で、それぞれのshRNAと蛍光タンパク質を同時に発現するアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)（pAAV-U6-ZsGreen1, タカラバイオ社:AAVpro Helper system）を作製した。shRNAの配列は、Bioneer社Accutarget Genome-wide Predesigned siRNAの配列を参考にした。（作製されたベクターの発現により緑色蛍光が観察され、また力価は1-4x10^10/ml程度であった。）作成されたAAVベクターを島根大の大谷らの方法で胎生後期（E16）の胎仔舌粘膜組織にインジェクションし、当該候補遺伝子のin vivoのRNA干渉を試みた。AAVベクターは微少マグネットビーズ試薬と混合し複合体（OZ Bioscience in vivo ViroMag）とし、注入部位確認のため着色料を添加した。インジェクション２日後に胎仔試料を採取し、４％PFA固定の後、凍結切片の作製と上皮、基底膜、血管内皮関連遺伝子のRNAプローブによるISH (ACDignostics社RNAScope)・HE染色を行い、組織を観察した。インジェクションによる大きな組織変化は見られなかったが、さらに詳細な検索を継続する。本研究は本学組み換え実験安全委員会・動物倫理委員会の承認済である。