2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of gene transfer to peripheral tissues surrounding tooth (GTPT) for the tissue around the root forming apex of juvenile mice and its application
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16K11810
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
窪田 直子 鹿児島大学, 医歯学域歯学系, 助教 (40569810)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 正宏 鹿児島大学, 総合科学域総合研究学系, 教授 (30287099)
稲田 絵美 鹿児島大学, 医歯学域附属病院, 助教 (30448568)
野口 洋文 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50378733)
齊藤 一誠 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (90404540)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 生体内遺伝子導入 / PiggyBacシステム / CRISPR/Cas9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ヒトの歯根形成に関わる遺伝子の探索、その機能解明を最終目標として、独自に開発した方法を用いて幼若マウスの歯根形成端周囲組織に遺伝子（DNA）を直接注入することで、歯根形成に重要とされるFGF-10やIGF-Iの機能をin vivoで模索することを目的とした。また、トランスポゾンを用いた導入遺伝子の宿主染色体への挿入による遺伝子発現の定着化、最近開発された次世代型KO技術による標的遺伝子のKOの可能性を探った。
piggyBac（PB）トランスポゾンシステムによる遺伝子の長期持続発現に関する検討では、初代乳歯歯髄細胞に蛍光遺伝子（EGFP cDNA）内蔵のトランスポゾンと transposase発現ベクターをNeon electroporation system（Invitrogen社）を用い共遺伝子導入を行った。その結果、効率的な遺伝子導入安定株の取得、導入遺伝子の長期発現が認められ、PBシステムの有効性が確認された。
また、in vivoにおける歯根形成端周囲組織での持続的遺伝子（EGFP cDNA）発現を検討した。その結果、遺伝子導入後1.5ヶ月を経過すると遺伝子発現の程度は導入後1日目に較べると格段に低下するが、持続的なEGFP発現を認めた。更に、導入遺伝子の存在も歯根形成端周囲組織から抽出したゲノムDNAを用いたPCRで確認した。
一方、標的遺伝子を破壊するためのCRISPR/Cas9系の作動性を検討するため、Cas9と表的遺伝子を含むguide RNA（gRNA）を同時に発現するベクターを構築し、ブタ細胞に遺伝子導入した結果、標的遺伝子破壊に成功した。故に、CRISPR/Cas9系を稼働させるための条件設定もその作動性も経験し、本番たるGTPTを用いたin vivoゲノム編集に十分準備が整った。
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