2016 Fiscal Year Research-status Report
歯石によるインフラマソーム活性化機構の解明とその阻害薬を用いた歯周組織破壊の抑制
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16K11836
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
吉村 篤利 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (70253680)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮崎 敏博 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (10174161)
原 宜興 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (60159100)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 歯周炎 / 歯石 / インフラマソーム / 結晶 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯周炎患者では歯石沈着により症状が悪化することが知られているが、我々は、先行する予備実験において、歯石中のリン酸カルシウム結晶がインフラマソームと呼ばれる蛋白複合体を活性化し、マクロファージのIL-1β産生を誘導することを明らかとした。IL-1βは強力な炎症性サイトカインで歯周組織破壊に大きな影響を及ぼすことが知られている。本研究では、① 実際に、歯周組織でインフラマソームの活性化が起きているかどうか、② 歯肉上皮細胞を歯石で刺激すると、ピロトーシスと呼ばれるインフラマソーム依存性細胞死が誘導されるかどうか、③ 歯石によるインフラマソーム活性化を、食物中成分や、低分子インフラマソーム阻害薬により抑制できるかどうか、を明らかにすることを目的とした。
平成28年度は、実際に歯周組織でインフラマソームの活性化が起きているかどうかを明らかにするために、長崎大学病院に来院した歯周炎患者10 名に研究内容を説明し、同意を取得した上で、歯周基本治療前の歯周炎患者の 4 mm 以上の歯周ポケットから歯肉溝滲出液を採取し、IL-1βをELISA法で検出した。また、歯周炎患者５名から歯石を採取し、末梢血多形核白血球および単核球を刺激し、IL-1β産生量を測定した。その結果、歯肉溝滲出液中にIL-1βは検出され、歯石で刺激後の末梢血多形核白血球および単核球培養上清中にもIL-1βは検出された。このことから、実際に、歯周組織でインフラマソームの活性化が起きていると考えられた。
また、マクロファージを歯石存在下で培養した後、iPGellに封入・固定し、電子顕微鏡観察を行ったところ、マクロファージは濃度依存的に歯石を取り込んでいた。このことからも、実際に歯周ポケットにおいて、歯石は貪食細胞に取り込まれ、インフラマソームの活性化を介してIL-1βの産生に促進的に作用していると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度の研究結果から、実際に歯肉溝滲出液中にIL-1βが検出され、歯周ポケットにおいてIL-1β産生に必須のインフラマソームの活性化が起きていることが理論的に証明された。また、歯周病患者から採取した歯石で刺激後の末梢血多形核白血球および単核球培養上清中にIL-1βが検出されたことから、微小歯石粒子にインフラマソームを活性化してIL-1βを誘導する作用があることが証明された。また、歯周病患者から採取した歯石が、実際にマクロファージに貪食されることが電子顕微鏡観察により証明された。これらのことから、歯周組織で実際に歯石によるインフラマソームの活性化を介したIL-1βの産生が起きていると考えられ、平成28年度に予定していた研究計画をほぼ達成できたと判断し、研究の進捗状況はおおむね順調と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度の研究結果から、歯周組織で実際にインフラマソームを介したIL-1βの産生が起きていることは、ほぼ間違いないと考えられる。したがって、平成29年度には、当初の計画通り、歯石中結晶が歯肉上皮細胞のピロトーシスを誘導するかについて検討する。
まず、滅菌スケーラーを用いて歯肉縁上・縁下歯石を採取する。採取した歯石は、貪食可能な大きさまで細かく粉砕し、蒸留水で洗浄後に 55 μmフィルターで濾過し、これ以上の大きさの粒子を取り除く。さらにオートクレーブで滅菌し、凍結乾燥したものを歯石試料として用いる。
次に、ヒト口腔上皮細胞株HSC-2細胞を歯石および歯石の主要な構成成分であるハイドロキシアパタイト(HA)結晶(市販の 40 nm、150 nm、<2 μm のものを購入)で刺激し、12～24 時間後の培養上清中の 乳酸脱水素酵素（LDH）濃度を測定することにより、細胞死の誘導率を測定する。またこの実験で、ピロトーシスの誘導に歯石に含まれる菌体成分の刺激が関与するかどうかも検討する。
ピロトーシスはインフラマソームおよびカスパーゼ1が活性化することにより誘導されるので、カスパーゼ1阻害剤 z-YVAD-fmk 存在下で同様の実験を行い、その阻害効果について検討する。
HSC-2 細胞は、正常細胞とは感受性が異なることが懸念されるため、結果次第では、同様の実験をヒト口腔粘膜由来正常ケラチノサイトを用いて行い、その効果を検証する。
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| Causes of Carryover |
見積もり時の物品費・旅費の価格と購入時の価格に差が生じていたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の予算と合わせて、実際の購入価格に応じて調整して使用する。
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