red complex細菌の網羅的な遺伝子解析による歯周病診断マーカーの検索

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K11842
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 平塚 浩一 日本大学, 松戸歯学部, 教授 (80246917)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 歯周病 / 次世代シークエンス / マイクロアレイ / 診断 / Red complex / non-coding RNAs / 病原細菌

Outline of Annual Research Achievements

将来的に重篤化する可能性が高い歯周疾患か否かを，生息する細菌の病原性に着目して予測するマイクロアレイ技術を基盤とした診断法の開発が目的である。病原性遺伝子の発現とともに，それらの遺伝子発現に深い関係のあるnon-coding RNAs をバイオマーカーの候補として，歯周病に深い関わり合いを持つとされるred complex細菌 (P.gingivalis: Pg, T. forsythia: Tf, T. denticola: Td)に加え，侵襲性歯周炎の原因細菌，A. actinomycetemcomitans (A.a)を対象とし，次世代シークエンス（NGS）解析を行った。
平成28年度の計画の１つである「診断用アレイのプロープの決定」では，NGS情報から得られた，各菌株の遺伝子とnon-coding RNAsの発現情報を，NGS解析専用ソフトを用いて，発現プロファイリングと関連性をビジュアル化し，より効率的に解析を進めていく予定であったが，予定していた NGS解析専用ソフトの使用が困難であったため，NGS公開ソフトを使用し解析を進めた。
「菌種別カスタムマイクロアレイの作成・実験・解析」では， Stress負荷実験から抽出したP.gおよびA.aへのRNAを用いて，cDNA化後，蛍光標識を行った。各細菌のカスタムマイクロアレイ（non-coding RNA probe 含有）を作成し，ハイブロダイゼーション後，蛍光スキャナーにてシグナル強度を検出した。発現量をマイクロアレイ専用ソフトにて解析中であり，ストレス下での病原性遺伝子とnon-coding RNAとの発現の関連性を検討することで病態マーカーのエビデンスを取得中である。
また，健常者，慢性歯周炎（軽度・中等度・重度），侵襲性歯周炎患者から歯肉溝滲出液を採取し，適時RNA 抽出を進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

前年度までの科学研究費補助金で得られたRed complex細菌，およびAaの次世代シークエンス (NGS) 情報から，各菌株の遺伝子発現とnon-coding RNAs発現情報を含んだdatabaseを次世代シークエンス解析専用ソフト（Strand NGS software）を用いて，より詳細にmRNAおよび non-coding RNAsの双方の発現状況とそれらの関連性をビジュアル化し，non-coding RNAsを含めた発現遺伝子の塩基配列を効率的に解析し，カスタムマイクロアレイ上のprobe候補を決める予定であった。しかしながら，当初購入予定していたStrand NGS softwareが販売元のテクニカルサポートでの事前説明では，細菌を対象としたNGSの解析でも充分に機能するというお話であったが，購入を前提にしたプレインストール後のデモンストレーションで annotation情報の不十分な原核生物では該当ソストの機能が充分に使用できないことが判明し，発現遺伝子とnon-coding RNAsの関連性をより詳細に，かつ効率的にビジュアル化することが困難になり，公ソフトにて時間をかけなければならなくなったため。

Strategy for Future Research Activity

Tf, およびTdのStress負荷実験から抽出したRNAと各細菌別のカスタムマイクロアレイ（non-coding RNA probe 含有）を用いた発現解析を行い，ストレス環境下での病原性遺伝子とnon-coding RNAとの発現の関連性を検討し病態マーカーのエビデンスを取得する。
４菌種の全遺伝子（約8,000），並びに，NGS解析から見出したnon-codingRNAs（約2,400+α）をアレイ上にスポットした病態スクリーニング用カスタムアレイを作成する。前年度から収集している，様々な歯周病病態から採取・保存していた極微量RNAサンプルを，申請者が開発した 「歯周ポケット内生息細菌の病原性を直接モニタリング可能な診断法の開発（平成16年度-平成18年度）」にて，RNAを1~2μg相当まで増幅させる。cDNA化後，蛍光標識を施し，作成したカスタムアレイと反応させ，蛍光スキャナーにてシグナル強度を検出する。アレイ上の各probeに対するシグナル強度のデータを遺伝子発現ソフト（GeneSpring）に移行させ，各probeにおけるシグナル強度が，病態間で統計学的に有意な差異を示す遺伝子やnon-coding RNAを見出し，各病態における病態マーカーとする。
健常者，慢性歯周炎（軽度・中等度・重度），侵襲性歯周炎患者からの臨床サンプル（歯肉溝滲出液）の採取・RNA 抽出は引き続き進め標本数を増やす予定である。

Causes of Carryover

当初購入予定していたStrand NGS softwareが販売元のテクニカルサポートでの事前説明では，細菌を対象としたNGSの解析でも充分に機能するというお話であったが，購入を前提にしたプレインストール後のデモンストレーションで annotation情報の不十分な原核生物では該当ソストの機能が充分に使用できないことが判明し，マイクロアレイ解析用のソフトの使用に切り替えたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

８万弱なので予定しているカスタムマイクロアレイ作成を増やし，より客観性を担保する計画で進める。