2018 Fiscal Year Research-status Report

red complex細菌の網羅的な遺伝子解析による歯周病診断マーカーの検索

Research Project

Project/Area Number	16K11842
Research Institution	Nihon University
Principal Investigator	平塚浩一日本大学, 松戸歯学部, 教授 (80246917)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2020-03-31
Keywords	マイクロアレイ / 診断 / Porphyromonas gingivalis / 歯周病 / red complex / 遺伝子解析 / マーカー / 遺伝子発現
Outline of Annual Research Achievements	申請者は，長らく常在する口腔内細菌を標的とした歯周病診断用遺伝子発現アレイの開発を行ってきた．本研究は現行の歯周病が未治療のままでいると，将来的に歯周疾患が重篤化する可能性が高いか否かを予測する診断法の開発である．臨床分離される細菌のRNAは時として分解レベルが著しい場合がある．そのためタンパク質をコードするmRNAに加え，そのmRNAの分解や翻訳阻害を担う，サイズが小さいため分解を受けにくいnon-coding RNA をバイオマーカー候補として遺伝子データベースの情報を基に遺伝子発現マイクロアレイの加え作成済みである．歯周病に関連するRed complexに属する3菌種(P.gingivalis, T. forsythia, T. denticola)に加えて，侵襲性歯周炎患者から高頻度に検出されるA. actinomycetem-comitansに対して様々なストレス付加を行い、次世代シークエンサーを用いて発現するすべてのRNAを網羅的に解析済みであり（RNAseq），既にデータの構築が完了している．これらのデータとは別に，歯周病の病態マーカーを取得するために，健常者，慢性歯周炎（軽度・中等度・重度），および侵襲性歯周炎患者から歯肉溝滲出液の採取，RNA 抽出・増幅・標識後に作成済みのカスタムアレイを用いたプロトコールを実際に集めた資料の一部を用いて行い，より効率的な方法を模索した．具体的には企業が提示する原核生物用のプロトコールではごく微量（10 ng）の全RNAを用いて行う方法が推奨されていたが，以前から申請者が進めている一度全RNAからrRNAやtRNAを極力除いてmRNA-rich 試料をマイクロアレイ解析した方が，より発現レンジの広い解析が可能であることを比較実験で明らかとした．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 診断用アレイの開発に必須な, 研究協力者による健常者，慢性歯周炎（軽度・中等度・重度），侵襲性歯周炎患者等の各グループからの歯肉溝滲出液の採取の数のばらつきが大きく、その採取の遅れによって，解析するために充分な試料数が揃わなかったこと。加えて，冷凍庫で保存されていたRNAがマイクロアレイ実験の途中で分解されていることが判明したため，基礎実験である菌体の培養およびその後のストレス実験をやり直し、RNAを再抽出したことにより、大幅な遅れが生じた。さらに研究者の校務の多忙も遅れた要因の１つである。
Strategy for Future Research Activity	最終年度として，これまで収集した歯周病の様々な病態サンプルの解析を進めることにより，病態関連バイオマーカーの診断パネルの作成を目指す．極微量RNAサンプルを申請者が開発した増幅法 [基盤研究（Ｃ），研究代表者，「歯周ポケット内生息細菌の病原性を直接モニタリング可能な診断法の開発」平成16年度-平成18年度]にて，mRNA-rich 試料をIn vitro Transcription 反応によりmRNAを2μg相当まで増幅させる．cDNA化後，蛍光標識を施し，作成済みのカスタムアレイ上で反応させ，蛍光スキャナーにてシグナル強度を検出し，各遺伝子発現を解析して病態間での統計学的に有意な差異を示す遺伝子およびnon-coding RNAを見出すことで，各病態における病態マーカーを検索する予定である．
Causes of Carryover	診断用アレイの開発には，歯周病の各病態での歯肉溝滲出液中の細菌RNAの採取が不可欠である．健常者，慢性歯周炎（軽度・中等度・重度），侵襲性歯周炎患者から歯肉溝滲出液を採取等の臨床サンプルを取得するために，研究協力者にも臨床サンプルの採取をすでにお願い済みであるが，付属病院でのシステム変更や協力者の諸事情により，試料採取が遅れがちとなっている．加えて，保存していたRNAに分解が生じていることがわかり，基礎的実験である菌体培養・ストレス実験をやり直したことも遅延した原因となっている．次年度使用額に関してはマイクロアレイ反応後の蛍光強度測定のためのスキャンは業者に委託する予定であるため，その費用に企てる計画である。