A study of the diagnostic markers for periodontal disease by the comprehensive gene expression analyses of red complex bacteria

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K11842
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 平塚 浩一 日本大学, 松戸歯学部, 教授 (80246917)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 遺伝子 / 発現 / マイクロアレイ / 病原性 / 診断 / Red complex / 歯周病 / 細菌

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は，将来的に歯周疾患が重篤化する可能性が高いか否かを予測する診断法の開発である。歯周病病原細菌のうちRed complexに属するP. gingivalis，T. forsythia，T. denticola に加え，A .actinomycetemcomitans の４つの菌種におけるバイオマーカー候補として遺伝子にnon-coding RNA（ncRNA) を加えカスタムアレイ上のプローブ対象とした。ncRNAの検索にはイルミナ型次世代シークエンサーHiSeq 2000を用い，菌体に様々なストレス負荷し発現したRNAを網羅的に読み取り，リード数を数え，染色体上の遺伝子間配列（IGS）に存在した新規のncRNAと，in silicoで潜在的なncRNAsを予測してるデータベースを取り入れてncRNA候補とした。
酸性下（pH5.5)，アルカリ性下（pH9.0），好気条件下，コールドショック（16℃）下，あるいはヒートショック（45℃）下で菌体をそれぞれ一定時間暴露し全RNA抽出をおこなった。rRNAを除去後，増幅，cRNA蛍光標識し，菌種別カスタムマイクロアレイ（8x15K, Agilent）解析をおこなった。また，健常者，歯周疾患患者から歯肉溝滲出液を採取し，申請者が考案したRNAサンプル増幅法をおこなったのち，同様にアレイ解析し，病態間で有意な差異を示すプローブを調査した。
その結果，病原性の違いがすでに報告されているP. gingivalis研究株間での結果と，病態の異なる歯周疾患患者の結果では相似したパターンが一部見いだされた。今後の課題としては更に多くのサンプルを収集し精度を向上させると共に，歯肉溝浸出液等を試料に加え，そこから見いだされる生化学的データとの照合から多角的に菌体の遺伝子発現結果と歯周病病態との関連性を調査する方略で今後予定している。