2017 Fiscal Year Research-status Report
歯髄由来間葉系細胞中Muse細胞の特性解析と歯周組織再生医療応用への展開
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16K11844
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| Research Institution | Tsurumi University |
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Principal Investigator |
長野 孝俊 鶴見大学, 歯学部, 准教授 (10386914)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
金指 幹元 神奈川歯科大学, 大学院歯学研究科, 講師 (80339811) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2016-10-21 – 2019-03-31
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| Keywords | 歯髄 / 幹細胞 / SSEA-3 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年発見された幹細胞であるMultilineage Differentiating Stress Enduring (Muse)細胞の分離方法に着目し、歯髄細胞から特に表面抗原であるSSEA-3に陽性となる細胞を分離・培養する方法を樹立して、その標準化や効率化を図ることを目的に研究を継続した。
ヒト歯髄組織より幹細胞を分離する手法について様々な予備的検討を行った結果として、SSEA-3陽性細胞のみを採取する方法が効率的であると判断し、そのソーティング方法を確立した。ソーティングして得られた細胞を播種し、クラスター形成された細胞のみをピックアップして、ゼラチンコーティングしてあるプレート上で培養し、増殖した細胞を再度Poly-HEMAコーティングの96wellプレートにてシングル細胞となるように播種して培養を継続し、自己複製能を確認した。
また、三胚葉分化能については、RT-PCR法で確認した。今回はコントロールとして、ACTBとhGAPDHを使用した。内胚葉のマーカーとしてAFPと原始内胚葉マーカーであるGATA6を、中胚葉のマーカーとしてNkx2.5とBrachuyuryを、外胚葉のマーカーとしてMap-2を選択し、三胚葉性の遺伝子発現を確認することが出来た。
Muse細胞は表面抗原であるCD105とSSEA-3の抗体を用いて二重染色後、セルソーターにてソーティングを行い、96ウェルプレートにシングル細胞となるよう播種することで得られるとされているが、SSEA-3単独での分離を行った細胞でも、一定程度の幹細胞が得られることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究は、平成28年度途中での追加採択であり、半年以上遅れて研究を開始したため、全体の進行状況としてはやや遅れている。しかしながら、現在は既に歯髄組織から得られたSSEA-3陽性細胞の特性解析を開始しており、その分化能を検索中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
SSEA-3陽性細胞の特性解析に関する研究を進展させていく予定である。特に細胞増殖能と石灰化誘導能を中心に、MTSアッセイ、ALPアッセイ、カルシウム産生量の定量、硬組織分化マーカーの遺伝子発現の検索などを行い、効率的かつスピーディーな硬組織分化の条件を検討していく。
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| Causes of Carryover |
ヒト歯髄組織から得られたSSEA-3細胞の採取が順調に行われたため、当初の見込みよりも抗体やソーティング用試薬および細胞培養用試薬などの購入費用が下回ったため、次年度使用額が生じた。
今後は歯髄細胞由来のSSEA-3陽性細胞の特性解析を進めるため、細胞アッセイキットやPCRプライマーなどを購入し、実験を進展させる予定である。
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