2016 Fiscal Year Research-status Report
ヒト由来アメロゲニンペプチドに対する歯根膜幹細胞の遺伝子発現
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16K11847
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| Research Institution | Osaka Dental University |
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Principal Investigator |
田中 昭男 大阪歯科大学, 歯学部, 教授 (10121823)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
富永 和也 大阪歯科大学, 歯学部, 講師 (80278572)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 歯周組織再生 / 新規合成ペプチド / アメロゲニン / 細部増殖能 / 石灰化能 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯周組織の再生療法の一つにバイオリジェネレーションがあり、ブタの歯胚から抽出したエナメルマトリックスデリバティブ（アメロゲニン）が用いられている。これを基に７つのアミノ酸シークエンス（WYQNMIR）からなる物質を見出した。それは、ブタのアメロゲニンのエクソン５の部分配列である。これと類似のヒトのアメロゲニンはWYQSIRで６つのアミノ酸シークエンスからなっている。このヒト由来ペプチドに対するヒト歯根膜幹細胞の反応性を検討するのが本研究の概要である。
ヒトの非感染抜去歯の歯根膜組織を剥離し、細切して酵素処理後、培養し、細胞懸濁液を作製して、特殊なメッシュでろ過して、シングルセルにした。これを継代培養し、幹細胞の同定を行うために間葉系マーカー（Vimentin）、および間葉系幹細胞マーカー（STRO-1、SSEA-4）ならびにFITC標識抗体を用いて免疫染色して共焦点レーザー走査型顕微鏡で観察して幹細胞であることを確認した。
分離培養した歯根膜幹細胞を96 well マイクロプレートの1 well あたり一定の細胞数になるように播種し、10% FBS含有のDMEMで24時間培養し、ヒト由来のペプチドを1, 10, 100, 1000 ng/mLを加え、１，３，５，７日後に吸光度を測定し、細胞増殖能、アルカリフォスファターゼ活性を測定し、カルシウム沈着について定性および沈着量を算出した。
ヒト歯根膜幹細胞をヒト由来ペプチドで刺激すると、細胞増殖能は培養5日後で最も高く、次いで7日後であった。以前に行ったヒト由来細胞に対するブタ由来ペプチドの研究結果では、５日後よりも７日後に細胞増殖能は亢進したことから、ブタ由来ペプチドよりもヒト由来ペプチドのほうが、ヒト由来細胞に対しては影響が早めに現れる傾向が得られた。アルカリフォスファターゼ活性とカルシウム沈着については検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度では、研究計画の主体はヒト由来の歯根膜幹細胞を分離、培養し、同定するところまでであるので、細胞の同定までは順調に進行している。例数的には少ないので、増やす必要があるが、研究に適した条件の材料の入手が必ずしも順調でない。したがって、その面ではやや遅れているが、歯根膜幹細胞の分離培養については、技術的には問題はないが、コンタミが起こる率が高く、細胞の安定供給を得るのに時間を要している。次年度に実施するペプチドに対する細胞の反応性について予備実験的に進めてきている。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度は技術面での解決が主体であり、歯根膜組織から歯根膜幹細胞を分離培養し、同定することであったが、次年度はペプチドに対する歯根膜幹細胞の反応性を具体的に安定した結果を求めて実験を行うことになっている。すなわち、ペプチドに対する細胞増殖能、アルカリフォスファターゼ活性、カルシウム沈着の定性、カルシウム沈着量の測定および遺伝子発現の増減を検討する予定である。
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