口腔の健康に寄与する口腔細菌叢の機能解明を目指した未同定主要細菌の分離同定

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K11861
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 柴田 幸江 九州大学, 歯学研究院, 助教 (30274476)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山下 喜久 九州大学, 歯学研究院, 教授 (20192403)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 口腔連鎖球菌 / 唾液 / 分離同定

Outline of Annual Research Achievements

本研究は口腔健常者の唾液から菌種名が確定していないStreptococcus属を分離同定することを目的としており、対象者を九州大学歯学部学生として予防歯科の実習の中で口腔診査ならびに唾液採取を行う。しかしながら、今年度はカリキュラムの変更により予防歯科の講義・実習が行われなかったため、来年度に口腔診査ならびに唾液採取を行う予定である。よって、今年度は予備実験として医局員の唾液細菌叢を解析した。医局員13名（男性7名、女性6名：27-61歳）から唾液を採取して、染色体DNAを抽出した。16S rRNA遺伝子のV1-V2領域をPCR法を用いて増幅し、次世代シーケンサーを用いて塩基配列を解読して、被験者13名の唾液の細菌構成を決定した。その中に4種類の菌種名が確定していないStreptococcus属が存在し、平均構成比率はそれぞれ4.0%、3.4%、3.1%、0.4%、個人の最高構成比率はそれぞれ9.1%、8.7%、6.6%、0.9%であった。すでに報告している久山コホート研究の報告とほぼ同様の結果であった。構成比率の高い被験者から唾液を採取し、段階希釈を行って、Mitis-Salivarius寒天培地に塗布した。2日間、5% CO2存在下で培養後、さまざまな型のコロニーを20個ピックアップし，16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定したところ、S. salivariusが7個、S. parasanguinisが6個、S. vestibularisが3個、S. sanguinisが2個、S. dentisaniが1個で、残りの1個はNeisseria subflavaであった。現段階では目的のStreptococcus属の分離同定には成功していない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究の目的は九州大学歯学部学生を対象にして唾液中の菌種名が確定していないStreptococcus属を分離同定することであるが、今年度はカリキュラムの変更により予防歯科の講義・実習が行われなかったため、口腔診査ならびに唾液採取を行うことができなかった。しかしながら、予備実験により、目的のStreptococcus属の構成比率は対象集団が異なってもさほど差異が無いことが確認できた。

Strategy for Future Research Activity

九州大学歯学部学生を対象に口腔診査を行い、現在歯数が28歯以上、歯周ポケット深さが4 mm未満、プロービング時の出血がない、未処置のう蝕がない、処置歯が5歯以下の条件をすべて満たす学生に対して、本研究内容について説明し、同意が得られた学生を80名選択し、被験者とする。唾液採取は5分間のパラフィン咀嚼時の刺激唾液を採取する。
目的の細菌種の釣菌を最も効果的に行うため、被検者の唾液の細菌構成を解析し、釣菌しようとする細菌種の構成比率が高い被験者を細菌種毎に選別する。ビーズ破砕法を用いて唾液から抽出した細菌DNAをテンプレートとして16S rRNA遺伝子のV1-V2領域をPCRで増幅し、半導体シーケンサーを用いてシーケンスを行う。これらの配列について96％の相同性に基づき類似の配列を群分けすることで、生物学的には種レベルと同等の分類となるOperation Taxonomic Unit (OTU) を構築し、各OTUの代表配列をRibosomal Database Project IIのデータベース中のデータと最も近似する細菌種に割り振ることでそれぞれのOUTに該当する細菌種を推定して、唾液細菌叢の細菌構成を解析し、久山研究の結果と比較検討する。
菌種名が確定していないStreptococcus属について、細菌種毎に構成比率が高い被験者5名程度を選別し、再び唾液を採取してStreptococcus属の選択培地であるMitis-Salivarius寒天培地に塗布する。コロニー形態に注目してさまざまなコロニーをピックアップして培養し、染色体DNAを抽出して16S rRNA断片を増殖し、塩基配列を決定する。１細菌種について最低5株を目処として分離同定する。

Causes of Carryover

平成28年度は本研究の対象者から唾液採取を行うことができなかったため、染色体DNA抽出や塩基配列決定などに関する費用が予定していた金額を下回り、助成金の次年度への持ち越しが生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成29年度は本研究の対象者から唾液を採取して、染色体DNA抽出、PCR増幅、塩基配列決定などを行う。持ち越した助成金はこれらの作業に要する費用に当てる予定である。