胎児期化学物質曝露が動脈硬化症に及ぼす影響のエピゲノム及び血管生物学的解析

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K12608
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 森 千里 千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (90174375)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 江口 哲史 千葉大学, 予防医学センター, 助教 (70595826) ; 櫻井 健一 千葉大学, 予防医学センター, 准教授 (80323434)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: DOHaD研究 / DNAメチル化 / 動脈硬化症

Outline of Annual Research Achievements

動脈硬化症を基盤とした心血管疾患は我が国における死因の第一位となっており、その対策が急務である。疫学調査および実験的研究により胎児期環境が生活習慣病を含む様々な疾患に影響することが示唆されている。そこで、本課題「胎児期化学物質曝露が動脈硬化症に及ぼす影響のエピゲノム及び血管生物学的解析」では胎児期環境、特に化学物質への曝露が動脈硬化症に与える影響を明らかにするとともに、そのメカニズムを解明することを目指す。
本研究はヒトの新生児を対象として、DOHaD仮説に基づく動脈硬化症の発症メカニズム解明を目的としている。DOHaDのメカニズムの一つとしてDNAのメチル化が提唱されているが、DNAメチル化がどのような機序に基づいて動脈硬化症を引き起こすかの詳細なメカニズムは不明である。本研究においては、（1）化学物質曝露を含む胎児期環境因子による胎児への影響を臍帯動脈を用いて検討すること、（2）臍帯動脈で影響が認められたDNAメチル化領域に、特異的なメチル化状態の変化を挿入し、その領域のメチル化が血管構成細胞に及ぼす影響を明らかにすることを目指している。
本年度はすでに取得したDNAメチル化解析のデータを用い、虚血性心疾患などの動脈硬化性疾患と関連する胎児・新生児因子である出生体重と関連するDNAメチル化部位を抽出した。本検討の結果、出生体重と相関を認める複数の部位が得られた。これらの部位を標的としてDNAメチル化状態を変化させ、細胞機能への影響を明らかにする方法として、CRISPR-Cas9を応用した方法を用いることとした。そこで、この方法に用いるプラスミドベクターを入手し、増幅させた。今後、個別のメチル化制御用ベクターに改変し、細胞への導入を試みる予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究計画において、前年度までに研究を完了する予定であった。しかし、臍帯動脈からのDNA抽出法の最適化の遅れやDNAメチル化改変手法の選択などに時間を要したため研究の進捗が遅れ、研究期間の延長を申請した。前年度までに、DNAメチル化アレイの結果と出生体重を用いた解析を行い、研究対象とするCpGサイトの選択を完了した。また、DNAメチル化改変法の検討を行い以前と異なる方法を選択し、DNAメチル化改変に用いるベクターの入手を行なった。ベクターの入手に際しては、学内における遺伝子組み換え実験に関する手続きに時間を要したため当初予定よりも遅れてしまい、年度後半での入手となってしまった。そのため、研究の進捗が遅れる結果となった。しかし、上述のように、標的部位の選定とベクターの入手は完了しており、次年度は研究計画を進められる予定である。
上述の遅れに伴い、妊娠中母体血中化学物質濃度と関連するDNAメチル化領域の選定にも遅れが生じている。本年度までに、母体血中化学物質濃度（PCB等）の測定は完了しているので、次年度はこれらの物質と相関のある部位を抽出することができる。また、その際には、他の共変量も影響も考慮した上で行う。この結果を上述の細胞実験系に適用していく予定である。これにより、本申請課題の目的が達せられる見込みである。

Strategy for Future Research Activity

本年度は臍帯動脈DNAメチル化の網羅的解析の結果を用い、DOHaD仮説の重要な因子である出生体重を関連するDNAメチル化部位を抽出することができた。細胞生物学実験に関しても血管平滑筋細胞の入手はすでに完了し、新たに選択したDNAメチル化改変法に用いるベクターの入手も完了している。そのため次年度は研究の推進が可能と考えている。また、すでに測定を完了している妊娠中血中PCB濃度および臍帯血PCB濃度を用い、化学物質曝露と関連する臍帯動脈のDNAメチル化部位の抽出を行う予定である。共同研究者はヒトにおいて化学物質とDNAメチルの関連を解析した経験を持つため、順調な進捗が見込める。また、細胞生物学実験に関しては研究協力者と連携しながら進める予定であり、こちらに関しても今年度は推進できると考えている。
上述のように、次年度は共同研究者との連携をさらに強めていくことで、より強力に研究を進めていく予定である。

Causes of Carryover

本年度は細胞生物学実験の準備が遅れたため予算の残額が生じた。次年度は本年度の結果に基づき細胞生物学実験をおこなっていく。このため、細胞培養に関する試薬あるいは遺伝子導入用の試薬、領域特異的な修飾をするためのベクター作成用試薬などを購入するために予算が必要となる。これらの試薬あるいは培養細胞は比較的高額であり、そのための予算を計上する。また、細胞実験のためには人的サポートが必要であり、実験補助者の雇用の必要が生じる。実験補助者については、実験の補助のみならず、データの整理及び予備的な解析も担当してもらう予定である。このために次年度は人件費の予算を計上する。