2016 Fiscal Year Research-status Report
真菌の高反応酵素による層状マンガン酸化物生産とレアメタル回収等環境資源技術の開拓
| Project/Area Number |
16K12619
|
|---|
| Research Institution | Akita Prefectural University |
|---|
Principal Investigator |
宮田 直幸 秋田県立大学, 生物資源科学部, 教授 (20285191)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
東條 ふゆみ 秋田県立大学, 生物資源科学部, 特任助教 (90758228) [Withdrawn]
福島 淳 秋田県立大学, 生物資源科学部, 教授 (00181256)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | マンガン酸化酵素 / 遺伝子クローニング / 環境技術 / 金属資源回収 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
微生物が酵素反応で作り出すマンガン酸化物は層状の微結晶であり、優れた反応特性（金属イオン吸着、酸化、触媒性能）をもつため、環境・資源技術への応用が期待される。本研究では、真菌Acremonium strictum KR21-2株のマンガン酸化酵素をクローニングし、酵母を用いた大量発現系を構築する。そして、マンガン酸化の反応機構を明らかにするとともに、酵素反応で生成したマンガン酸化物の金属回収性能を明らかにすることを目的としている。平成28年度は、KR21-2株の培養菌体から抽出した全RNAを用いてcDNAライブラリーを作製し、マンガン酸化酵素（MCO）遺伝子配列を保持するクローン株をPCR法によりスクリーニングした。MCO遺伝子配列は、予めKR21-2株のゲノム配列情報から特定しておいた。この結果、614アミノ酸残基からなるビリルビンオキシダーゼ様MCOのcDNAを取得することができた。MCOタンパク質の推定されるN末端配列は、以前に報告したKR21-2株からの精製タンパク質の配列と一致していた。次に、酵母Pichia pastorisの組換えタンパク質発現系（Invitrogen社）を用いて、MCOタンパク質の調製を検討した。プラスミドベクターpPICZaAの分泌シグナル配列下流に取得したcDNA配列を挿入し線状化した後、Pichia X-33株に導入して組換え体を作製した。1 mM Mn(II)と0.05 mM Cu(II)を添加した平板培地に播種したところ、マンガン酸化物を形成するコロニーが得られた。その挿入DNA配列を決定した結果、目的とするcDNA配列を保持することが示された。この組換え体を液体培養し、培養液上清をSDS-PAGEで分析したところ、マンガン酸化活性を有する目的タンパク質の産生が確認された。本研究では、KR21-2株のMCO遺伝子をクローニングしてその配列を決定するとともに、MCO組換えタンパク質発現系を構築することができた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はKR21-2株のMCO遺伝子のクローニング及びPichia酵母を用いた組換えタンパク質発現系の構築までを目標としていた。MCO遺伝子のクローニングについては、全ゲノム配列情報をもとに遺伝子配列を推定していた。本研究で、mRNAから目的とするcDNA配列の取得に成功したことから、組換えタンパク質の発現まで研究を順調に進めることができた。Pichia形質転換株の液体培養時に銅イオンを添加することで酵素活性が安定的に検出されること、培養36時間で酵素活性が最大となることが示され、MCOタンパク質を大量調製するための培養条件を設定することができた。このため、今年度の研究目標は十分に達成できていると判断された。
|
| Strategy for Future Research Activity |
取得したMCOタンパク質を用いて、酵素反応によるマンガン酸化物の生成過程を解明することを1つの目標とする。MCOタンパク質を各種クロマトグラフィーで精製した後、ウサギに投与して抗MCO抗体を作製する。この抗体を利用して、マンガン酸化反応時のMCOの局在性を明らかにするとともに、マンガン酸化物結晶の成長過程をモニタリングする。また、酵素反応で生成したマンガン酸化物の構造特性や物性を電子顕微鏡観察やX線結晶回折解析により解析する。最後に、マンガン酸化物の機能評価として、レアメタル（Co, Ni, Ceイオンなど）に対する吸着性能を明らかにし、酵素反応でマンガン酸化物を形成させながら、金属イオンを連続的に取込むことができるか検討する。
|
| Causes of Carryover |
外注で抗体作製にかかる費用（その他経費）の執行を予定していたが抗体作製が完了せず、28年度中に執行できなかった。このため相当額を繰越金として、29年度前半に執行することとする。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
28年度繰越金は抗体作製費（その他経費）として、29年度前半に執行する。29年度に受け入れる経費は、試薬類等の物品費（消耗品）、旅費（国際環境地球生物学会、9月、オーストラリアでの成果発表を予定）、人件費（アルバイト代）として支出する計画である。
|
Research Products
(1 results)
