2016 Fiscal Year Research-status Report

エネルギー代謝を調節する核内受容体PPARδの新しい活性制御法の構築

Research Project

Project/Area Number	16K13044
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	橘敬祐大阪大学, 薬学研究科, 招へい教員 (30432446)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	樋野展正大阪大学, 薬学研究科, 助教 (90469916)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2018-03-31
Keywords	生活習慣病 / 核内受容体PPARδ / 翻訳後修飾 / 光クロスリンク
Outline of Annual Research Achievements	近年の食生活や運動不足に起因するエネルギー過剰の状態を解消することは、生活習慣病発症の予防に繋がる。骨格筋は糖や脂肪酸の燃焼に深く関わっている最大の臓器であり、骨格筋をターゲットとしたトレーニングによるエネルギー消費の促進や、トレーニング効果が得られる薬剤の開発が健康長寿社会を実現するためには重要である。核内受容体PPARδは、骨格筋の質の規定や骨格筋における脂肪燃焼を介したエネルギー消費の亢進に関与している。従って、PPARδの活性制御メカニズムの解明は、トレーニング効果が期待出来る生活習慣病の予防・改善法の確立に重要と考えられる。まず、ヒトの骨格筋におけるPPARδの機能を解析するために、培養細胞を用いた分化系の構築を行った。ヒト胎児横紋筋肉腫由来細胞株を用いて、培養条件を詳細に検討し、効率的かつ再現よく筋芽細胞から骨格筋へと分化させるin vitro分化系を構築した。次に、PPARδの転写調節に関わる翻訳後修飾について解析を行った。その結果、翻訳後修飾を受けるアミノ酸残基とその修飾の種類を明らかにした。この翻訳後修飾の有無によりPPARδの転写活性が変化したことから、リガンド非依存的な転写制御機構の解明に繋がることが期待できる。また、PPARδの相互作用因子を探索するために、光クロスリンクすることが可能な非天然型アミノ酸を有するPPARδを発現するためのシステムを構築した。従来の実験方法では、弱く相互作用している因子は免疫沈降等の実験操作の段階ではずれてしまい同定できない可能性があるが、本光クロスリンク法を用いた場合ではPPARδとそれら因子が共有結合するため、複合体を正確に解析することが可能となる。今後この非天然型アミノ酸を持つPPARδを利用することで、新たな相互作用因子の同定を目指す。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究課題では、トレーニング効果が期待出来る生活習慣病の予防・改善法を確立することを目指して、骨格筋においてエネルギー代謝の調節を担っている核内受容体PPARδについて翻訳後修飾や相互作用因子などに着目して解析し、PPARδの新たな転写活性制御機構を解明することを目的とする。骨格筋における分子の役割を解析する培養細胞としては、マウスC2C12細胞やラットL6細胞を分化させる系が簡便で広く用いられているものの、ヒト由来の骨格筋細胞を用いた分化系はこれまであまり用いられていなかった。今回、ヒト胎児横紋筋肉腫由来細胞株を用いた分化系を構築したことは、ヒトでの骨格筋細胞におけるPPARδの機能制御機構を明らかにする上で非常に有用であると考えられる。また、PPARδのリガンド非依存的な転写制御機構の一つの可能性として、翻訳後修飾による制御を見出した。さらに、その領域を介した相互作用因子を同定するために、光クロスリンク可能な非天然型アミノ酸を持つPPARδを発現するための技術を確立した。今後、これら技術を駆使してリガンドとは異なる活性制御メカニズムを解明することにより、新しい機構を介した制御法の構築に繋がる可能性があり、非常に意義深い結果と考えられる。このように本研究は、概ね順調に進展している。
Strategy for Future Research Activity	平成28年度までに、PPARδの翻訳後修飾の解析、及び光クロスリンク可能な非天然型アミノ酸を持つPPARδを発現するための技術を確立した。そこで平成29年度は、光クロスリンクにより相互作用因子の探索を行う。相互作用因子が同定できれば、PPARδの転写活性への影響や、樹立した骨格筋細胞分化系を用いてエネルギー代謝に関わる機能の解析を行う。これら研究を推進することで、骨格筋細胞におけるPPARδの翻訳後修飾や相互作用因子を介した機能制御機構を解明し、トレーニング効果が期待出来る新たな生活習慣病の予防・改善法の確立へと繋げる。
Causes of Carryover	骨格筋細胞株を用いた分化系の構築実験、及び、PPARδの翻訳後修飾の同定を行うにあたり、様々な可能性を考え種々の検討実験を計画していたものの、当初想定していたよりも順調に研究が進んだため研究費の節約ができた。また、光クロスリンク実験に供与するためのPPARδ変異体を15個作製する必要があったが、その作製過程において実験のノウハウを得るとともに、作業の効率化に取り組んだところ、コスト削減に繋がったため未使用額が生じた。
Expenditure Plan for Carryover Budget	次年度は、計画に従い上記の構築した分化系や変異体を用いて相互作用因子の同定、機能解析等を実施する予定であるが、その際には残額を次年度の研究費に上乗せすることで研究の迅速な遂行など有効に活用することを計画しており、これらを実行するために使用させていただきたい。