2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of protein-labeling probes with OFF-ON-OFF fluorescence switches
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16K13088
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
堀 雄一郎 大阪大学, 工学研究科, 准教授 (00444563)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 蛋白質分解 / 分子力学計算 / タグ / ラベル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
蛋白質の分解は、細胞周期やシグナル伝達などの様々な生命現象を制御しており、その異常は癌や神経疾患などの原因となることが知られている。このため、蛋白質の分解を可視化する技術の開発は極めて重要である。これまでに、我々は、PYPタグと合成蛍光プローブを用いた蛋白質のラベル化・蛍光イメージング技術の開発を行ってきた。この技術では、遊離状態では非蛍光性でラベル化すると蛍光性となる発蛍光プローブを用いて、細胞内の蛋白質を洗浄操作なしで蛍光イメージングすることが可能である。一方、蛋白質が分解されるとラベル化したプローブが蛍光を発し続けるため、蛋白質の分解を生細胞でリアルタイムに検出することが困難であった。この問題を解決すべく、昨年度までの研究において、PYPタグのリガンドを7-ヒドロキシクマリンとしたプローブを開発した。このプローブは、遊離状態では非蛍光性で、ラベル化すると蛍光性となり、トリプシンで蛋白質が分解されると再び蛍光強度が抑制される性質を示した。一方、プローブの蛋白質ラベル化に20時間近くかかることから、ラベル化速度の改良が必要であった。本年度は、ラベル化速度を改良すべく、プローブ及びPYPタグの改変を行った。まず、ラベル化時にプローブからチオフェノールが脱離することに着目し、脱離能の高いチオフェノール誘導体をプローブに導入した。次に、リガンドと蛍光色素の間のリンカーに着目し、最適なリンカー長を分子力学計算でシミュレーションした。最後に、静電相互作用を最適化したPYPタグ変異体を開発した。その結果、30分程度でラベル化できるまでに、本技術を改良した。更に、この改変したプローブとタグを用いたとき、蛋白質の分解に伴いプローブの蛍光強度が減少することを確認した。以上により、迅速に蛋白質をラベル化し、蛋白質分解を検出する技術の開発に成功した。
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