2016 Fiscal Year Research-status Report
有用海洋シアノバクテリアの培養株構築と生合成遺伝子の解析
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16K13091
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
末永 聖武 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 教授 (60273215)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 海洋シアノバクテリア / 培養株化 / 全ゲノム増幅 / 生合成遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、有用物質の生産能力が高い海洋シアノバクテリアを培養株化し、その全ゲノム配列を明らかにし、生合成遺伝子の探索を行う。
これまでに、当研究室で単離構造決定した化合物を生産する海洋シアノバクテリアについて、種々培養条件を検討しているが、増殖速度が遅く、培養株化は達成できていない。そこで、並行して少量の鋳型遺伝子から全ゲノム増幅を試みることとした。
リポペプチドであるカナミエナミドを生産するシアノバクテリアについて、温和な条件でコンタミの原因となる鞘を除去したのち、ピペット洗浄法によりシアノバクテリアの純度の高いフィラメントを取り出し、ゲノムDNAを抽出した。ついでREPLI-g UltraFast Mini Kitを用いてMultiple Displacement Amplification（MDA）法により全ゲノム増幅を行った。増幅したゲノムDNAを蛍光試薬を用いた蛍光測定により定量し、電気泳動により鎖長を確認した。さらに増幅したゲノムDNAの純度と目的のシアノバクテリア由来遺伝子かの確認を16S rDNAの増幅・配列解析によって評価した。現在、次世代シークエンサーを用いた網羅的配列解析とバイオインフォマティクス的手法を用いた生合成遺伝子の探索を進めている。なお、今回解析に用いたサンプルの元の海洋シアノバクテリアにカナミエナミドが含まれていることも、抽出分離・NMRスペクトルによって確認済みである。カナミエナミドの化学合成についても研究を進めており、カナミエナミドの大環状構造の構築に成功した。
現在、他の数種の海洋シアノバクテリアについても、ゲノムDNA抽出と全ゲノム増幅を検討しており、適切なサンプルが得られることが確認できたら、網羅的配列解析・生合成遺伝子の探索を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
培養株化は達成できていないが、研究当初から困難なことを予想していた。そこで克服するための手段として、生物量に依存しない方法である全ゲノム増幅を行い、網羅的配列解析に必要なゲノムDNAサンプルを調製することができた。コンタミの原因となる鞘の除去に、ピペット洗浄法が有効に機能していることが確認できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
カナミエナミド生産シアノバクテリアのゲノムDNA増幅に成功したので、今後は網羅的配列解析・生合成遺伝子の探索を進めていく。コンタミの原因となる鞘の除去、ピペット洗浄法が有効に機能していることが確認できたので、この手法を他の海洋シアノバクテリアにも適用し、全ゲノム増幅によりDNAサンプルを調製する。これらの研究には海洋シアノバクテリアのサンプル鮮度が重要であるので、沖縄・奄美地方で採集を行い、新鮮なサンプルを採集して本研究に用いる。
また、現在のところ達成できていない、有用物質を産生する海洋シアノバクテリアの培養株化については引き続き検討を進める。特に１８員環マクロリドのビセリングビアサイド類を産生する海洋シアノバクテリアについて、重点的に検討を行う計画である。
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| Causes of Carryover |
使用額はほぼ計画通りである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
溶媒や試薬代として活用する。
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