2016 Fiscal Year Research-status Report
Nanodiscとセルフリー合成系による創薬基盤技術の構築
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16K13096
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
車 兪徹 東京工業大学, 地球生命研究所, 特任准教授 (40508420)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 抗体医薬 / 試験管内選択 / 無細胞タンパク質合成系 / GPCR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
抗体医薬は、従来の低分子医薬とは異なり、身体が持つ免疫システムを利用し、ガン細胞など特定の細胞を狙い打ちする画期的な医薬品である。本研究の狙いは、抗体作製に関わる主要プロセスを全てin vitroで行い、ハイスループット化によるシステマティックな生産・解析基盤を構築することである。
Nanodiscを調製するため、membrane scaffold protein 1（MSP1）（HisTag付き）をアフィニティークロマトグラフィー、及びゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。この精製産物を、リン脂質と界面活性剤存在下で混合した後、界面活性剤濃度を低下させることで、Nanodiscを自己集合的に形成させた。最後に再びゲル濾過カラムを通すことで純度の高いNanodiscを調製した。最終精製したNanodiscを280nmの吸光度から濃度を定量した。調製したNanodisc（ND）を無細胞タンパク質合成系に投入し、ND存在下でモデル受容体膜タンパク質であるbacteriorhodopsin（bR）を合成した。合成後、NiNTAマグネットビーズで処理することで、Nanodiscを反応液中から単離した。これをさらにanti-HAtag抗体マグネットビーズで処理することで、bRを含んだNanodiscのみを単離した。またbRが膜上で正しい立体構造を維持し多ことを示唆する呈色反応が観察された。
ランダム配列を持つライブラリーの作成するため、mRNAディスプレイ用と、リボソームディスプレイ用の27アミノ酸のランダム配列を含む鋳型DANをデザインした。これまでに、ライブラリー投下による無細胞系内でのペプチド合成と反応液からの単離に成功している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
抗原となる、bRのin vitro合成と、２種のタグによる２ステップの単離精製には成功した。しかし抗体配列のプールとなるランダム配列の操作について、当初考えていたよりも時間がかかっている。用いる手法として、mRNAディスプレイとリボソームディスプレイを採用しているが、前者に関してはin vitro転写後のタグ配列の付加効率と翻訳産物の同定について、後者に関してはランダム配列のベクターへのligation効率とゲルからの切り出し効率について多くの条件検討を繰り返している。mRNAディスプレイ系に関しては、しかしながら、合成産物の同定と、反応液からの単離に成功した。
これらの結果から、本研究は概ね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
無細胞タンパク質合成系により得られたランダム配列と、先に合成したbRナノディスクを混合し、bRに特異的に結合する配列を選択する。使用しているマグネットビーズに非特異的に結合するmRNAが確認されたたため、デコイのRNAにより前処理をおこなうことで、これらの非特異結合を軽減することを狙う。
また、リボソームディスプレイ法に関しても、ライゲーション効率と切り出し精製効率の向上化を目指し、無細胞系によるランダム配列合成が行える状況を目指す。
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