2017 Fiscal Year Research-status Report
Nanodiscとセルフリー合成系による創薬基盤技術の構築
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16K13096
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
車 兪徹 東京工業大学, 地球生命研究所, 特任准教授 (40508420)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 抗体医薬 / 無細胞タンパク質合成系 / Nanodisc / GPCR / 受容体膜タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
モデルGPCRであるバクテリオロドプシン（bR）を人工脂質膜であるNanodiscを添加した無細胞合成系で合成し、膜挿入率１００％の状態で単離した。
これを抗原と見立て、ランダムな20アミノ酸のプールから得意的に結合する配列を選択した。ランダムアミノ酸のライブラリーはNNB配列を20回反復させることで、stopコドンの出現を抑えた。また翻訳後の複合体形成を保てるよう、ランダム配列の下流に安定した立体構造をとる既知の配列を配置した。蛍光標識されたPuroタグをアニーリングしたところ、約８０％以上の効率でラベル化することに成功した。さらに無細胞系で合成した産物をゲル泳動で確認したところ、鋳型mRNAよりの泳動度が短いバンドが検出された。これは、ランダムなペプチドを提示したとみられる、mRNA-Puroタグ-ランダムペプチドの複合体の形成を示唆するものである。さらにこのバンドをStrepタグを認識する抗体を用いてウエスタンブロッティングしたところ、泳動度が同じウエスタンのバンドが検出された。これらの結果から、２０アミノ酸のランダムペプチドが系内で正しく合成され、その遺伝型であるmRNAと複合体を形成していることが確認できた。
この状態でmRNAディスプレイのセレクションサイクルを回し、RT-PCRによるバンド出現のサイクルパターンを解析することで、ターゲットに強く結合する配列が濃縮されるタイミングを待っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ランダムな20アミノ酸がが正しく合成されていること、合成後にきちんと複合体を形成していることが確認できた。また高純度でNanodisc-膜タンパク質複合体を単離することができている。そのためおおむね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに、高度好塩菌由来のバクテリオロドプシン（bR）をモデル受容体膜タンパク質として系を走らせてきた。しかしbRは、脂質膜外のドメインが非常に小さく、ランダムライブラリーからセレクションするには困難なモデルである可能性が出てきた。また、人の疾患に直接関わるタンパク質ではない。
そのため、人由来の重要疾患に関わる受容体膜タンパク質にターゲットを移し、よりペプチドを選択しやすいモデルで系を確立させることを今後の方針とする。
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| Causes of Carryover |
２０１７年度に国際共同研究加速基金に採択された。これに伴い、海外の研究室で一定期間研究を行うことが義務づけられている。そのため、国内で本課題を進める時間が削られたため、消耗品試薬の消費が大幅に減った。このため、次年度使用額が生じた。
次年度では、合成遺伝子発注等の実験消耗品費として使用することを計画している。
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