Elucidation of intracellular signal transductions by use of point mutated proteins and molecular tools

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K13101
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 加藤 修雄 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (50150537)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: タンパク質間相互作用 / 14-3-3タンパク質 / フシコクシン / コチレニン

Outline of Annual Research Achievements

14-3-3タンパク質は、クライアントであるリン酸化タンパク質を捕捉することで様々な細胞内信号伝達を調節するアダプタータンパク質である。ヒトの14-3-3には７種のアイソフォームがあるが、未だそれらの存在意義や特異的機能の詳細は明確ではない。本研究は、14-3-3点変異体と低分子ツールを用いることで、アイソフォームの機能を解明することを目的とした。具体的には、野生型よりクライアント捕捉能に劣る14-3-3点変異体と、点変異体とクライアントの会合のみを選択的に安定化できる低分子化合物を用い、それらが与える表現型解析を研究戦略とした。
ジテルペン配糖体・フシコクシン（FC）やコチレニン（CN）は、14-3-3とクライアントの会合状態を安定化するが、CN型のヒドロキシ基をアミノ基に置き換えたamino-FCは、こうした安定化能を示さない。その要因は、14-3-3のFC/CN会合サイト近傍に存在するLys残基とFCアミノ基との静電反撥であると考えられた。そこで、このLysを点変異させた14-3-3を取得し、クライアントモデルペプチド（FAM-KRSH-pS-X-COOHおよびFAM-KRSH-pS-XP-COOH）との会合体形成能とamino-FCおよびその誘導体による会合能回復を蛍光偏光解消法によって評価した。野生型14-3-3にはζアイソフォームを用い、そのLys120をGln, Glu, Met, Alaとした点変異体を取得した。点変異体のモデルペプチド会合能は、いずれの場合も野生型より著しく減弱した。期待したamino-FC誘導体での会合能の回復も見られたが、その程度は十分ではなかった。ただ、amino-FCのurea型誘導体を用いると、野生型と同一のX残基選択性が確認でき、より有効な誘導体を創出できれば、アイソフォーム解析に適用可能な手法になり得ると考えられる。