Application of epitope-tag insertion for the analysis of synaptic molecules splicing isoform expressions in the brain

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K13107
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 井端 啓二 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (30462659)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ゲノム編集

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、シナプス分子の局在を解明するために、抗体を作る代わりにCRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いて、抗原(エピトープタグ)そのものを目的シナプス分子をコードする遺伝子にノックインすることによって、その局在を解析する技術を確立する事、特に、抗体が存在しないNeurexinのスプライスサイト4バリアントの時空間的発現プロファイルを明らかにする事が目的である。
平成29年度は、前年度に得られた結果をもとに、Neurexinのスプライスサイト4へのタグの挿入を試みた。マウス受精卵へガイドRNAとCas9の導入は電気穿孔法にて行った。その結果３種類のガイドRNAを試みたが、いずれもゲノム切断後のindelのみが起こり、タグが挿入された個体は得られなかった。そこで他のシナプス分子へタグの導入を試みた。シナプス形成分子であるCblnファミリー分子にはCbln1から4の４種類が存在するが、高い相同性を持つ事から、特異的な抗体を作製するのが難しい。そこでHAタグをそれぞれのN末端またはC末端に挿入する事を試みた。その結果、Cbln2のゲノムにHAタグの配列を挿入する事が出来た。
Cbln1に関しては、前年度にHAタグを挿入した個体が得られているため、マウス個体でのCbln1とCbln2の発現部位や細胞内局在の違い、さらに同じエピトープタグを使用しているため、個体での発現量の違いに関しても今後明らかにする予定である。また、同様にNeuroliginファミリー分子の一つであるNeuroligin1にHAタグ配列が挿入された個体を得る事が出来た。CblnとNeuroliginはどちらもNeurexin分子に結合する。そのため各シナプスにおけるCbln/Neuroliginタンパク質の量比に違いがあるかに関しても今後明らかにしていく予定である。