高曲率膜を識別するペプチドプローブの開発とエキソソーム解析への応用

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K14013
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 佐藤 雄介 東北大学, 理学研究科, 助教 (90583039)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: エキソソーム / 蛍光プローブ / 高曲率性 / イメージング

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではエキソソーム解析に特化した分析ツールの開発を目的として、エキソソームの高曲率性膜を識別する蛍光性ペプチドプローブの開拓を目指す。高曲率性膜の結合モチーフとなるα-helixを分子内クロスリンクで効果的に誘起し、さらに疎水場感受性蛍光色素を付与することで、エキソソーム（直径30-120 nm）に対して優れた結合能を示す蛍光応答型ペプチドプローブを開発する。
アポリポプロテインA-IのC末端22残基をベースとして、そのN末端にNBD付与し、N末端から5番目、9番目をエチルスペーサーにより分子内クロスリンクさせたペプチドを固相上にて合成した。固相からの切り出し後、逆相HPLCにより単離精製した。
CDスペクトル測定により、合成したプローブはPBS緩衝液中で46%程度のα-helix含有量を有していることが分かった。この値はクロスリンク化していないコントロールペプチドと比べて22%も大きいものであり、分子内クロスリンクがα-helix構造の誘起に有用であることが分かった。次に、phosphatidylcholineから成る合成リポソームに対する蛍光応答を検討した結果、プローブが高曲率性を有するリポソームに選択的に結合し、NBD由来の発蛍光応答を示すことを見出した。この蛍光応答は、コントロールペプチドと比較して、著しく大きなものであることから、分子内クロスリンクによりリポソームに対する結合力が強化されることが示唆される。ここで用いた２つのペプチドプローブはリポソーム結合時において同程度のα-helix含有量（55%）を示すことから、合成したプローブでは分子内クロスリンクによりα-helix構造が効果的に誘起されるこどで、リポソーム結合におけるプローブの構造変化に伴うエントロピー損失を低減される結果、高い結合力を発現したものと考えている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究で提案するペプチドプローブの鍵となる、ペプチド構造の精密制御により、高曲率製膜に対する高い結合力が発現する可能性を見出した。

Strategy for Future Research Activity

クロスリンク化部位、クロスリンク剤の種類を変化させた一連のプローブ群を合成し、そのα-helix形成能、合成リポソームに対する基礎性能を網羅的に評価し、プローブ機能の最適化を図る。最適化されたプローブを用いて、細胞から分泌されるエキソソームならびに体液中に含まれるエキソソームに対する結合能、蛍光応答を評価し、エキソソーム検出能を評価する。その後、培養細胞中におけるプローブのエキソソーム蛍光ラベル化へと展開し、受容細胞へのエキソソーム融合過程のイメージング解析を試みる。

Causes of Carryover

研究実験に必要な試薬で2706円で購入できる適当なものはないため、次年度の消耗品購入に使用することとした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度始めの試薬購入の際に使用する。