2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of an innovative optical method for absolute quantification of the number of enzyme molecules in single living cells
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16K14016
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
小澤 岳昌 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 教授 (40302806)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 蛍光 / イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，ヘテロな細胞集団から構成される特定の一細胞内酵素数を絶対定量する革新技術の開発を目的としている．細胞内の分子数をカウントするために，光活性化型ルシフェラーゼとmEos2を自己切断型P2Aペプチドで連結した融合タンパク質を作成する．細胞内ルシフェラーゼ数は，mEos2と１：１の化学量論比で存在するため，mEos2を計測することにより求まる．H29年度は，生きた細胞内のmEos2の分子数をカウントするために，独自に開発した全反射蛍光顕微鏡システムを更に改良して，細胞内オルガネラ膜上に局在させたmEos2の分子計測技術を開発した．ミトコンドリア膜上タンパク質の一つであるBakにmEos2を連結し，内在性BakをノックアウトしたMEF細胞を試料とした．次に微弱な緑色光を細胞に連続照射し， mEos2の光変換を誘導しつつ，全反射蛍光顕微鏡によりmEos2輝点の高速イメージングを行った．結果，mEos2が完全に褪色するまでの時間，輝点の数からmEos2の分子数が計測できることを明らかにした．次にmEos2をアクチンに連結した遺伝子を作成し，細胞に発現させた．生きた培養細胞を用いて上記と同様の1分子イメージングを行ったところ，アクチンの超解像イメージング画像が取得できるとともに，mEos2の分子数をカウントできることがわかった．さらに，ルシフェラーゼとmEos2-アクチンをP2Aペプチドで連結した遺伝子を作成した．この遺伝子からタンパク質を発現すると，P2Aペプチドで自己切断されるため，ルシフェラーゼとmEos2-アクチンタンパク質は１：１の化学量論比で細胞内に発現する．現在，ルシフェラーゼの発光量とmEos2との相関を取得している．
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