2017 Fiscal Year Annual Research Report

PCR based on Surface Plasmon Enhanced Site-selective Heating

Research Project

Project/Area Number	16K14022
Research Institution	Kyoto Prefectural University
Principal Investigator	石田昭人京都府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (20184525)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2018-03-31
Keywords	表面プラズモン共鳴 / SPRセンサ / プラズモン増強加熱 / プラズモン電場加熱 / 超高感度免疫分析 / DNAポリメラーゼ / 病原性大腸菌 / 抗体マイクロアレイ
Outline of Annual Research Achievements	食中毒やインフルエンザ、エボラ熱などの感染症は社会にとって大きな脅威である。特にO157やノロウイルスはわずか数個の病原体で発症するため、感染の予防や制御には極微量の病原体を迅速に検出・同定できる検査法が不可欠となる。しかし現在用いられている培養法やイムノクロマトなどは感度や迅速性の点で食品業界や医療現場のニーズに見合っていない。そこで、検体中の病原体1個を迅速・確実に検出する分析デバイスの開発を目的として研究を行った。分子センサに使われる表面プラズモン（SP）は金表面に局在する電場で表面の誘電率変化に伴って共鳴条件が変わる。このような特徴を持つSP電場を微小熱源として利用することで、病原体が結合した抗体のみ共鳴させ加熱することでDNA伸長を起こし、小さい病原体1個を大きなDNAの塊にして蛍光染色することにより、高感度で検出・計数するという全く新しい分析法を考案した。厚さ50 nmの金基板に直径6 mmのシリコンゴム製ウェルを貼り付け、抗IgG抗体と抗BSA抗体をそれぞれ直径1 mmのスポット状に修飾した。これらの抗体にはあらかじめM13プライマーを修飾した。直径3 umラテックスビーズにγ-グロブリンを修飾し、病原体モデルを作製した。これらの病原体モデルをウェルに加えて免疫反応を起こし十分に洗浄した後、RCA液を注入し、808 nm、0.8 Wレーザを共鳴角＋2度のオフセット角でウェル全面に30分間照射した。DNA産物をSYBR Green Ⅰで染色し、共焦点顕微鏡で観察した。抗IgGスポットに結合した病原体モデル粒子からDNAの強い蛍光が観察され、蛍光像の輝点を画像処理ソフトで数えることにより病原体の計数が可能となった。病原体モデルが結合した抗体近傍のみをSP電場により１選択的に加熱するという本研究の分析概念の実証に成功した。