2016 Fiscal Year Research-status Report
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16K14023
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
安川 智之 兵庫県立大学, 物質理学研究科, 教授 (40361167)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 電解還元析出 / DNAアプタマー / 白金錯体 / インターカレーション / プロトン触媒還元 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的はターゲット分子を含む溶液中に分子認識素子であるDNAアプタマーとシグナル変換素子である白金錯体を混合するだけで，高感度計測可能な電気化学システムを構築することである．本研究では，アプタマーにインターカレートしている白金錯体が電解還元されず，「ターゲット分子の認識により初めて白金錯体を遊離してシグナル変換」することができるワンステップ化と白金錯体の電解還元による電極表面上への白金のナノ粒子を析出によるプロトン触媒還元能の付与による高感度化を実現した計測システムを提案する．
まず，白金錯体の電解還元による白金微粒子の析出に伴うプロトン触媒還元電流を利用した白金錯体の検出を行った．プロトン触媒還元能のないグラッシーカーボン（GC）電極を用いて白金錯体を電解還元すると電極表面上に白金ナノ微粒子が形成された．この電位においてプロトンは白金微粒子表面上で触媒還元され，白金ナノ微粒子の形成および成長に伴う還元電流とプロトンの触媒還元電流が同時に観測された．プロトンの触媒還元電流は，白金錯体の還元電流と比較して数十倍大きく高感度な白金錯体の検出ができることがわかった．この計測は，GC電極，ダイヤモンドライクカーボン電極，インジウムスズ酸化物（ITO）電極を用いて行うことができた．特に，ITO電極を用いた場合の電流増幅が大きい．
トロンビンアプタマーとその相補的配列を有する1本鎖DNAを混合した場合の触媒還元電流を評価できた．アプタマーの存在下においてプロトン触媒還元電流が変化することから，アプタマーを計測することが可能となった．また，アプタマー－白金錯体の解離定数を評価できた．さらには，溶液を加温・冷却することにより2本鎖の形成とインターカレーションする白金錯体量が増加することにより再現性が増加した，現在，トロンビン存在下におけるプロトン触媒還元電流の評価を最優先で行っている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた研究実施項目について，すべてに着手し遂行することができた．一部は，現在も研究中であるが，当初予定の研究以外にも成果が出ており学会発表も行った．したがって，平成28年度に行われた研究は，おおむね順調に進展していると判断している．
白金錯体の電解還元による触媒電流応答の調査では，高感度な白金錯体の検出およびアプタマー存在下における電流応答の検出を達成しており，トロンビン計測へと展開できている．平成29年度には，この検出原理を利用したトロンビン計測，さらには，平成29年に予定していた「低分子センシングシステム」への展開が可能な段階に達した．これにより，競争法を用いない低分子計測が可能になり，本研究で提案する新規計測システムの構築が現実的となる．
当初予定していた研究以外の成果として，電気化学活性種で修飾したアプタマーを用いたコカインセンサの開発を行った．この方法は電極にアプタマーを固定化しなければならないが，測定対象物質であるコカインのアプタマーへの結合による電気化学反応の増加を原理としているため，結合した測定対象物質と結合していない測定対象物質を洗浄により分離する必要のない簡便なセンサの開発に成功した．
また，インジウムスズ酸化物（ITO）電極を用いた電解還元により，電極の電気化学特性を大きく変化させることができる可能性を見出し，次年度の新たな展開が期待できる．
平成28年度は，トロンビンをモデルターゲットとした高感度な電気化学計測法の開発において大きな研究進展があり，今後の固定化不要で競合法を用いない低分子センサの開発体制を整えることができた．
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度において，「白金錯体の電解還元によるプロトン触媒還元電流応答」および「相補的配列への白金錯体のインターカレーション」により，モデルであるトロンビンの添加に伴い遊離されるフリーの白金錯体を検出することができた．
平成29年度は，まず，この検出原理を用いて，固定化不要で競合法を用いないnMオーダーのトロンビン計測を達成する．トロンビンの添加により，ループ構造DNAアプタマーの開裂を誘起し，白金錯体を溶液中に遊離する．この遊離白金錯体濃度は，添加したトロンビン濃度に依存するため，電解還元によるプロトン触媒反応を利用することにより，添加したトロンビン濃度を反映する白金錯体濃度を評価できる．トロンビンを認識せずに白金錯体をインターカレートしたまま溶液中に残るループ構造アプタマーも存在するが，2本鎖の層内に挿入された白金錯体は電極表面上でほとんど還元されないため，遊離した白金錯体の検出を阻害しない．このことを実験的に実証し，本測定系の検出下限濃度（nMレベル），迅速性（数分），簡便性（溶液を混ぜるだけ）における有用性を示す．
さらに，ターゲット分子の拡充を行い，本手法の有用性を確立する．すでに，アプタマーによる認識が報告されているアルカロイドを対象とする．ここでは，ニコチンとドーパミンをモデルターゲットとして利用する．抗体を用いた低分子の免疫測定ではサンドイッチ型計測法を適用できないため，競合法による計測が適用されるが，ターゲット分子と同じ分子を測定系に仕込む必要がある．すなわち，毒劇物を測定対象とした場合，その毒物を仕込んだ測定系を構築しなければならないところにデメリットがある．そこで，低分子に対する測定法としての本システムの有用性を示し，競合法を用いない低分子測定を可能にする．
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| Causes of Carryover |
当初，平成28年度の研究計画では，グラッシーカーボン（GC）電極を用いてプロトン触媒電流の実験を行う予定であった．しかし，GC電極を使用した実験では，GC電極を繰り返し使用するために，電極表面上に析出させた白金を研磨により毎回取り除く必要があった．この析出した白金粒子の除去作業により電極表面を傷つけたり，除去不足が再現性の乏しい結果の要因であることがわかった．そこで，比較的安価で使い捨てができる電極材料の探索を行い，インジウムスズ酸化物（ITO）電極を候補として実験を行った．多くの会社がITOの薄膜を製造販売しているが，その成分比率は開示されていないことが多く，各社の製品で電気化学応答が異なる．そこで，いくつかのITO電極の電気化学応答を調査し，本研究に最適な電極の探索を行い，次年度に最適な電極材料を購入し実験を行う計画としたため，次年度使用額が生じた．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
前年度に，最適な電極材料の探索ができたため，今年度はその電極を用いてトロンビンおよび低分子をモデルターゲットとした高感度な電気化学計測法の開発研究を遂行する．当初，電極の研磨による再生を予定していたが，研磨再生の再現性の乏しさから，電極を使い捨てることとした．比較的安価な電極材料であるITO電極を利用する予定である．今年度，そもそも高価であるアプタマーと電極材料の購入に使用し，実験を繰り返すことにより，再現性が高く，高感度なセンサを開発する．アプタマーあたりの捕捉白金錯体数を増大させることによる高感度を行う．そのためには，鎖長の長いアプタマーが必要となるため，長鎖DNA分子の合成に使用予定である．さらには，アプタマーとの相互作用の大きい白金錯体の使用を検討しており，その新規合成に使用する予定である．
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