2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K14023
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
安川 智之 兵庫県立大学, 物質理学研究科, 教授 (40361167)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 電解還元析出 / DNAアプタマー / 白金錯体 / インターカレーション / プロトン触媒還元 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的はターゲット分子を含む溶液中に分子認識素子であるDNAアプタマーとシグナル変換素子である白金錯体を混合するだけで，高感度計測可能な電気化学システムを構築することである．本研究では，アプタマーにインターカレートしている白金錯体が電解還元されず，「ターゲット分子の認識により初めて白金錯体を遊離してシグナル変換」することができるワンステップ化と白金錯体の電解還元による電極表面上への白金のナノ粒子を析出によるプロトン触媒還元能の付与による高感度化を実現した計測システムを提案している．
昨年度は，トロンビンアプタマーを用いた固定化不要で競合法を用いないトロンビン計測を行った．白金錯体を含む溶液中で電解還元を行うと，電極表面で白金錯体が還元され電極表面上に金属白金が析出し，プロトンの触媒還元電流が観測された．ここに，トロンビンアプタマー溶液を添加すると，白金錯体がアプタマーに配位し，白金の電解還元析出が阻害され触媒電流は観測されなかった．さらに，トロンビンを添加すると，触媒還元電流の増加が観測された．これは，アプタマーがトロンビンと結合し，白金錯体が遊離されたためである．添加したトロンビン濃度の増加に伴い，プロトン触媒還元電流が増加した．本測定系の検出下限濃度は数十nMレベルであり，溶液を混ぜるだけの簡便な測定法である．
さらに，アプタマー修飾微粒子を用いた誘電泳動によるトロンビンの簡易計測法を開発した．微粒子に固定化されたアプタマーにトロンビンが結合することにより，微粒子表面の表面電荷量（表面導電率）が減少し，負の誘電泳動から正の誘電泳動に切り替わる交差周波数が低周波数側にシフトした．この交差周波数を計測することによるトロンビンの簡易定量を可能にした．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
トロンビンアプタマーに白金錯体が結合した複合体に，トロンビンを添加するだけで，トロンビンを計測できる測定法を開発できた．トロンビンの添加により，トロンビンアプタマーに結合していた白金錯体が遊離し，プロトンの触媒還元電流が増加することを利用している．この手法により，競争法を用いない低分子計測が可能になり，本研究で提案する新規計測システムの構築が可能となる．本件については，昨年度の電気化学会にて学会発表を行った．
初年度に引き続き，電気化学活性種で修飾したアプタマーを用いたコカインセンサの開発を行った．測定対象物質であるコカインのアプタマーへの結合による電気化学反応の増加を原理としているため，結合した測定対象物質と結合していない測定対象物質を洗浄により分離する必要のない簡便なセンサを開発できた．この手法は，法規制分子であるコカインのような危険ドラッグ類を，あらかじめ仕込んでおかなければならない競合法ではないことが大きな利点となる．
ITO薄膜電極を用いた白金錯体の電解還元では，ITO表面上に金属白金が析出しプロトン触媒電流が観測される．しかし，白金錯体が存在しない場合には，電解還元により電子移動反応速度の向上が観測された．現在，この現象について詳細に調査中である．
当初予定していた研究以外の成果として，アプタマー修飾微粒子の誘電泳動を利用したトロンビンセンサを開発した．この方法では，アプタマーを修飾した微粒子の誘電泳動挙動が，トロンビンの添加に伴うトロンビンの結合による大きな変化を利用している．この成果は，特許出願（特願2018-69360）した．
以上のように，当初予定のトロンビン計測法に加え，電極の活性化現象や誘電泳動法の融合等，多岐の応用展開ができたため，当初の計画以上に進展していると判断している．
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度の研究において，新たにわかってきたITO電極の活性化による電子移動反応速度の向上について詳細に検討する．ITO電極電位に負電位を印加すると大きな還元電流が流れるとともに，電極の色が無色透明から茶褐色に変化する．また，電解還元した電極を用いた電気化学活性種の酸化還元応答は，電解還元を行わない電極の応答と比較して，ピークセパレーションが小さい理論的な酸化還元波に近い大きな酸化還元電流応答が得られる．この現象を説明するために，X線光電子分光法を用いて各処理を行った電極表面の組成分析を行い，走査型電子顕微鏡で微細な表面形状を観察する．これにより，ITO電極の活性化による電子移動反応速度の向上のメカニズムを解明する．さらに，この活性化ITO電極を用いて，白金の電解還元に伴うプロトンの触媒還元反応を用い，トロンビン検出の高感度化を行う．
また，アプタマー修飾微粒子の誘電泳動を利用したトロンビンセンサの開発を継続して行う．微粒子に固定化したトロンビンアプタマーにトロンビンが結合すると微粒子表面の電荷量が減少し交差周波数が低周波数側にシフトすることを見出した．今後は，微粒子サイズ，溶液導電率，電極形状の最適化を行い，検出感度を向上させる．微粒子サイズが小さいと交差周波数は高周波数側に移動するので，低周波数領域で起こる電気浸透流現象の影響を無視できるので有利である．しかし，粒子サイズの減少によりブラウン運動の影響が顕著になり，誘電泳動による集積化が困難になる．そこで，各電極デザインに対する最適な粒子サイズを調査し，高感度化につなげる．また，測定対象をトロンビンからペプチド，小分子へと拡張する．
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| Causes of Carryover |
当初目的としていた白金錯体の高感度電気化学測定を利用した簡便なトロンビン（モデルターゲット）計測に関して有用な結果を得ることができた．しかし，やや再現性に乏しかったため原因を精査したところ，電極の初期活性のばらつきが問題であることがわかってきた．そこで，電極の活性化処理を行うと，特定の電気化学活性種に対する応答の回復が観測されることがわかった．この現象を解明し，本センサシステムを確立するためにも継続して研究を実施する必要がある．また，誘電泳動を組み込んだまったく新規なトロンビン計測法の可能性を示せた．本件に関しても，さらに深く追求するとともに，学会発表および論文発表を行う必要があり，次年度使用額が必要である．
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