2016 Fiscal Year Research-status Report
microRNAの画期的な迅速、高感度検出法の開発
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16K14027
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| Research Institution | National Defense Medical College |
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Principal Investigator |
武井 史恵 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究, 進学課程, 准教授 (30252711)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | miRNA / RT-PCR / 蛍光分子 / HP－PCR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本提案では、PCRを基盤とした簡便、高感度なmiRNA検出法の開発を主目的とし、HP-PCR法を使ったmiRNA検出法を開発する。この方法を実用的な技術に仕上げするために、下記３つの目標を設定した。
1) RT-HP-PCR法を使ったmiRNA検出法の構築、2) DNAプローブを用いた蛍光増大型HP-PCR法（Hpro-PCR法）とmiRNA検出法の開発、3) 新規蛍光分子の開発によるHP-PCR法、Hpro-PCR法の高性能化
本年度は主に1)のRT-HP-PCR法を使ったmiRNA検出法の構築について検討した。
このmiRNAの検出には、我々が開発したHP-PCR法が応用できるのではないかと考えた。HP-PCR法は、PCRのプライマーの5’末端をDNAで修飾し、DNAの二次構造に特異的に水素結合する蛍光分子DANPを使ってプライマーを蛍光ラベル化する。PCRが進行するとへアピン構造が開いてDANPが遊離し、蛍光が減少するという蛍光を使ったPCRモニタリング法である。この方法の場合、現在主に行われているTaqman probe を用いた場合と異なり、共有結合で蛍光分子をDNAに結合させる必要がない。つまり、蛍光分子、プライマー、miRNAを混合すると簡単にmiRNAの検出ができる利点がある。実際にOne-step RT-PCRキットを使って逆転写からPCRまでを連続して行うと、DNAプライマー部分がmiRNAに結合して逆転写が進行すると同時に、蛍光強度変化が観測され、この方法で簡単にmiRNAの検出ができることが示唆された。さらにヘアピンプローブPCR法（Hpro-PCR法）を使っても逆転写が効率的に進み、mIRNAの検出が可能であることがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在、miRNA検出用のプライマーの設計はほぼできている。あとはヘアピンプライマーPCR(HP-PCR), ヘアピンプローブPCR（Hpro-PCR)法用のプライマーで、タグ部分の関与によって目的外の増幅が起きなければ、使える技術として発表できるところまで来ている.
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| Strategy for Future Research Activity |
この研究をさらにPCRを基盤とした簡便、高感度なmiRNA検出法の開発へと発展させていく。具体的な目標としては、当初目的の2) DNAプローブを用いた蛍光増大型HP-PCR法（Hpro-PCR法）とmiRNA検出法の開発、3) 新規蛍光分子の開発によるHP-PCR法、Hpro-PCR法の高性能化を目指す。また系中でRNAから成熟型miRNAを産生し、混合物中でもmiRNAの検出できる系へと発展させる。さらに至適条件を使って、夾雑物存在下でも成熟型RNAを特異的に検出可能な系に仕上げる。最後に実際の現場を想定して患者の血液から抽出した血清を用いてRT-Hpro-PCR法でのmiRNA検出が可能であることを実証する。
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| Causes of Carryover |
予定していたRNA、DNA、試薬の購入費が計画していたほどかからず、また器具もすでにあったため、消耗品費が当初予算よりも少なくなったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本年度は大量にRNAを使った実験を行うために、予定通り、消耗品費として使用する。
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